【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物工程，尤其涉及一種應用于蜜蜂蜂群的rnai的方法。
技術介紹
1、蜜蜂(西方蜜蜂)作為世界上最重要的傳粉者，在促進農業生產，維持生態平衡方面具有重要意義。對蜜蜂遺傳資源、基因功能和社會行為的研究有助于理解生物基因功能和行為機制。rna干擾(rnai)技術被認為是研究昆蟲基因沉默的基因功能的有效的工具，自問世以來就在生命科學領域受到了廣泛關注。目前在蜜蜂中，rnai僅應用于實驗室中的離群蜜蜂的基因功能研究。基于蜜蜂的真社會性，探究以蜂群為單位的蜂產品產量、環境適應性和蜂群行為等相關的關鍵基因和分子機制具有重要意義。然而，由于rnai操作的復雜性，dsrna的需求量和自然環境的不確定性等原因導致rnai沒有在蜜蜂蜂群中實施。
2、目前利用rnai進行基因功能的研究中常用的導入方法主要有注射和飼喂。注射法顯然不適宜用于田間環境，而飼喂需要大量的dsrna。不同于化學合成，pet28-bl21(de3)rnaseiii-細菌表達系統已被證明是一種有效的大量表達dsrna的方法。除此之外，還可以將dsrna與納米載體星聚陽離子(spc)結合，通過納米載體攜帶雙鏈rna進入昆蟲體內，以達到rnai的增效作用。如此既可以量產dsrna又能提高rnai效率，然而在蜜蜂研究中還沒有此類應用。
3、基于spc和pet28-bl21(de3)rnaseiii-細菌表達系統，我們建立一種應用于蜜蜂蜂群的rnai的方法，在實驗室環境下應用于離群蜜蜂進行驗證后，成功應用于野外環境中帶有自動喂食裝置的小蜂箱內的蜂群。
技術實現思路
1、本專利技術的目的是為了解決現有技術中蜜蜂rnai技術中dsrna表達量不足、rnai效率低，無法應用于蜜蜂群體等缺點，而提出的一種應用于蜜蜂蜂群的rnai的方法。
2、為了實現上述目的，本專利技術采用了如下技術方案：
3、一種應用于蜜蜂蜂群的rnai的方法，包括以下具體步驟：
4、s1：對蜜蜂飲食偏好性進行探究，明確飼喂大腸桿菌對蜜蜂的影響；
5、s2：探究在蜜蜂腸道液的作用下，納米材料spc對大腸桿菌pet28-bl21(de3)rnaseiii-系統表達的dsegfp的保護性；
6、s3：明確利用納米材料spc遞送rna能夠提高蜜蜂rnai的效率；
7、s4：基于大腸桿菌表達和納米材料遞送dsrna，在自然條件下的蜂群中應用rnai。
8、作為本專利技術的進一步技術方案，所述s1中，具體包括以下步驟：
9、s1a：飼養西方蜜蜂作為研究對象，每個蜂群在飼養條件、群勢和飲食方面盡量保持一致；
10、s1b：采集新出房的工蜂，飼養在養蜂籠中并置于恒溫恒濕培養箱；
11、s1c：培養大腸桿菌溶液至od600＝1，離心取上清收集沉淀，利用等量的蜂蜜水重新溶解后得到新的菌液，其中一部分菌液進行超聲破碎，另一部分不做處理；
12、s1d：分別飼喂實驗蜜蜂單獨的蜂蜜水、超聲破碎后的菌液和未處理的菌液，另外分別飼喂實驗蜜蜂這三種溶液中的兩種；
13、s1e：記錄處理后2、4、6、8、10天蜜蜂的食物消耗量并分析結果。
14、作為本專利技術的進一步技術方案，所述s2中，具體包括以下步驟：
15、s2a：利用pet28-bl21(de3)rnaseiii-系統表達dsegfp后，1μgdsegfp與spc以不同質量比(16：1、8：1、4：1、2：1和1：1)混合，在室溫下靜止15min后，進行瓊脂糖凝膠電泳實驗；
16、s2b：使用無菌鑷子收集蜜蜂的完整腸道，進而得到蜜蜂腸道液原液，用pbs稀釋后腸道液與1μg?dsegfp混合后進行瓊脂糖凝膠電泳實驗；
17、s2c：將1μg?dsegfp、1μgdsegfp與250ng?spc(4：1)的混合液、1μg?dsegfp與50％腸道液混合液和1μg?dsegfp與spc和50％腸道液混合液進行瓊脂糖凝膠電泳，并分析條帶亮度。
18、作為本專利技術的進一步技術方案，所述s2b中，具體的操作為：使用無菌鑷子收集大約30只蜜蜂的完整腸道至一個干凈的1.5ml離心管，使用超聲波研磨機(50赫茲，30秒)進行徹底研磨，利用低溫離心機離心(12000r，5min)，取上清作為實驗用的腸道液原液，用1倍的pbs將腸道液稀釋為100％、75％、50％、25％、12.5％、6.25％和3.125％，并與1μg?dsegfp混合，使其最終濃度為50ng/μl，在室溫條件下保存1.5h后進行瓊脂糖凝膠電泳實驗。
19、作為本專利技術的進一步技術方案，所述s3中，具體包括以下步驟：
20、s3a：選擇防御素(def)和凋亡抑制劑(iap)基因作為靶基因進行rnai實驗，利用pet28-bl21(de3)rnaseiii-系統表達dsdef和dsiap；
21、s3b：將上一步獲得的菌液在10000r下離心1min，棄去上清液，用固定比例的蜂蜜水重新懸浮沉淀，隨后用超聲破碎儀(桿6，開始2s，停止3s，60％功率，30min)破碎，獲得從大腸桿菌中釋放的dsdef和dsiap，重復這一步驟，直到菌體被完全破碎；
22、s3c：上一步獲得的dsrna、spc、未轉入質粒的超聲破碎后的大腸桿菌和dsegfp分別飼喂蜜蜂，其中飼喂蜜蜂蜂蜜水和dsegfp作為對照組；
23、s3d：在處理后的第2、4、6、8和10天，對蜜蜂dsdef和dsiap基因表達水平進行檢測。
24、作為本專利技術的進一步技術方案，所述s3a中，利用pet28-bl21(de3)rnaseiii-系統表達dsdef和dsiap的具體操作為：分別合成880bp的def和417bp的iap基因片段序列，該序列由一段cds區基因序列、該cds區基因序列的反向互補序列和能夠形成莖環結構的額外dna序列組成；將這兩個片段序列克隆到質粒pet-28a中，并將重組質粒pet28-def和pet28-iap分別轉化到大腸桿菌bl21(de3)rnase?iii-中，并擴大培養；當菌液od600達到0.4左右時，加入異丙基-d-d-硫代乳糖苷(iptg)誘導表達dsrna，37℃繼續培養4h后得到分別大量表達dsdef和dsiap的大腸桿菌。
25、作為本專利技術的進一步技術方案，所述s3c中，具體的操作為：上一步獲得的dsrna，其中一部分以質量比為4：1加入spc另一部分不加，在室溫下保持15min后，分別飼喂給步驟s1b條件下的蜜蜂；同時飼喂蜜蜂固定比例的蜂蜜水，該蜂蜜水稀釋的未轉入質粒的超聲破碎后的大腸桿菌和蜂蜜水稀釋的pet28-bl21本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種應用于蜜蜂蜂群的RNAi的方法，其特征在于，包括以下具體步驟：
2.根據權利要求1所述的一種應用于蜜蜂蜂群的RNAi的方法，其特征在于，所述S1中，具體包括以下步驟：
3.根據權利要求1所述的一種應用于蜜蜂蜂群的RNAi的方法，其特征在于，所述S2中，具體包括以下步驟：
4.根據權利要求3所述的一種應用于蜜蜂蜂群的RNAi的方法，其特征在于，所述S2b中，具體的操作為：使用無菌鑷子收集大約30只蜜蜂的完整腸道至一個干凈的1.5mL離心管，使用超聲波研磨機(50赫茲，30秒)進行徹底研磨，利用低溫離心機離心(12000r，5min)，取上清作為實驗用的腸道液原液，用1倍的PBS將腸道液稀釋為100％、75％、50％、25％、12.5％、6.25％和3.125％，并與1μg?dseGFP混合，使其最終濃度為50ng/μL，在室溫條件下保存1.5h后進行瓊脂糖凝膠電泳實驗。
5.根據權利要求1所述的一種應用于蜜蜂蜂群的RNAi的方法，其特征在于，所述S3中，具體包括以下步驟：
6.根據權利要求5所述的一種應用于蜜蜂蜂群
7.根據權利要求5所述的一種應用于蜜蜂蜂群的RNAi的方法，其特征在于，所述S3c中，具體的操作為：上一步獲得的dsRNA，其中一部分以質量比為4：1加入SPc另一部分不加，在室溫下保持15min后，分別飼喂給步驟S1b條件下的蜜蜂；同時飼喂蜜蜂固定比例的蜂蜜水，該蜂蜜水稀釋的未轉入質粒的超聲破碎后的大腸桿菌和蜂蜜水稀釋的pET28-BL21(DE3)RNaseIII-系統表達的dseGFP作為對照組；每個處理進行3個重復。
8.根據權利要求5所述的一種應用于蜜蜂蜂群的RNAi的方法，其特征在于，所述S3d中，具體的操作為：在處理后的第2、4、6、8和10天，每次隨機選取5只蜜蜂，利用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)對蜜蜂dsDEF和dsIAP基因表達水平進行檢測；結果表明蜜蜂dsDEF和dsIAP基因表達水平在處理組中均被顯著抑制，且具有SPc組的RNAi具有更高的效率和更長的有效期，說明SPc可以顯著提高RNAi的效率。
9.根據權利要求1所述的一種應用于蜜蜂蜂群的RNAi的方法，其特征在于，所述S4中，具體包括以下步驟：
10.根據權利要求1-9任一所述的方法在蜜蜂蜂群中的應用。
...【技術特征摘要】
1.一種應用于蜜蜂蜂群的rnai的方法，其特征在于，包括以下具體步驟：
2.根據權利要求1所述的一種應用于蜜蜂蜂群的rnai的方法，其特征在于，所述s1中，具體包括以下步驟：
3.根據權利要求1所述的一種應用于蜜蜂蜂群的rnai的方法，其特征在于，所述s2中，具體包括以下步驟：
4.根據權利要求3所述的一種應用于蜜蜂蜂群的rnai的方法，其特征在于，所述s2b中，具體的操作為：使用無菌鑷子收集大約30只蜜蜂的完整腸道至一個干凈的1.5ml離心管，使用超聲波研磨機(50赫茲，30秒)進行徹底研磨，利用低溫離心機離心(12000r，5min)，取上清作為實驗用的腸道液原液，用1倍的pbs將腸道液稀釋為100％、75％、50％、25％、12.5％、6.25％和3.125％，并與1μg?dsegfp混合，使其最終濃度為50ng/μl，在室溫條件下保存1.5h后進行瓊脂糖凝膠電泳實驗。
5.根據權利要求1所述的一種應用于蜜蜂蜂群的rnai的方法，其特征在于，所述s3中，具體包括以下步驟：
6.根據權利要求5所述的一種應用于蜜蜂蜂群的rnai的方法，其特征在于，所述s3a中，利用pet28-bl21(de3)rnaseiii-系統表達dsdef和dsiap的具體操作為：分別合成880bp的def和417bp的iap基因片段序列，該序列由一段cds區基因序列、該cds區基因序列的反向互補序列和能夠形成莖環結構的額外dna序列組成；將這兩個片段序列克隆到質粒pet-28a中，并...
【專利技術屬性】
技術研發人員：單金瓊，陳超，徐齊，鄒禹妃，湯嬌，
申請(專利權)人：中國農業科學院蜜蜂研究所，
類型：發明
國別省市：
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