【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于熒光pcr檢測，具體涉及一種特異性引物nf1、探針和發菜真偽鑒定實時熒光pcr檢測方法。
技術介紹
1、發菜(nostoc?flagelliforme)是一種陸生藻，又名發狀念珠藻，屬于藍藻門(cyanophyta)念珠藻科(nostocaceae)念珠藻屬(nostoc)，外形呈黑色細長狀，猶如人的發絲，得名發菜。發菜被列入ⅰ級國家重點保護的野生植物名錄。生于我國新疆、寧夏、青海、甘肅等地，被視為山珍之一。發菜具有較高的食用、藥用和保健價值，不僅含有多種人體所必需的氨基酸、微量元素和維生素。其生物活性成分既能夠在體內外直接清除自由基，又具有特殊的抗腫瘤活性，其作用機制與抑制腫瘤細胞增殖、誘導細胞死亡以及抑制細胞的侵襲遷移有關.此外，發菜還有較強的免疫作用，可以提高患病或正常動物的免疫功能。
2、但是由于長期以來人類對于野生資源的過度開發利用，加之環境變化等多種因素的影響，發菜面臨資源減少、草場退化和沙化等危機，近年來這一現象已引起有關專家和產業部門的重視。
3、由于發菜價格較貴，市場上常有假發菜出現，如有些商販用玉米須染色曬干制成假冒發菜，而假冒發菜從形態上已經無法與發菜起到有效區分，不利于海關、市場監管準確執法。
技術實現思路
1、本專利技術的目的在于提供一種特異性引物nf1、探針和發菜真偽鑒定實時熒光pcr檢測方法。該特異性引物探針組的靈敏度高和特異性強，可準確地將發菜與其他相似形態的藻類區分開來，便于海關、市場監管準確鑒定真假發菜。p>
2、為實現上述目的，本專利技術提供如下技術方案：
3、一種特異性引物nf1：
4、上游引物f的核苷酸序列為：5′-ttgagaattcgccgcttca-3′；
5、下游引物r的核苷酸序列為：5′-ccgacatcggtggaaatga-3′。
6、一種引物探針組，包括上述特異性引物nf1和探針nf1-p，所述探針nf1-p的核苷酸序列為：5′-fam-cccactgcccagcgcctgttc-tamra-3′。
7、作為優選，所述探針nf1-p的5′端為fam熒光報告基團，3′端的淬滅基團為eclipse。
8、引物探針組的優點：
9、通過選取發菜hk基因序列設計開發了引物探針，通過該引物探針可將發菜與沼澤念珠藻、林氏念珠藻等其他11種念珠藻進行區分，表明其具有良好的特異性和靈敏度。
10、本專利技術還提供了上述引物探針組的應用為：發菜及其發菜制品的真偽鑒定。
11、由于發菜相關產品中含有發菜dna，因此本方法還可以用于發菜制品中發菜成分的檢測。
12、本專利技術還提供了一種用于發菜真偽鑒定實時熒光pcr檢測方法，該方法包括如下步驟：
13、s01、模板dna提取
14、樣品研磨打碎，取100mg粉樣于1.5ml離心管中，加入ctab提取液600μl，充分振蕩混勻。65℃水浴30min，不時顛倒混勻；10000r/min離心5min，取上清，等體積氯仿(三氯甲烷:異戊醇＝24:1)抽提一次；取上清，再加入2倍體積的ctab沉淀液，室溫沉淀1h，12000r/m離心10min，棄上清；加入350μl?nacl溶液溶解沉淀，再用等體積氯仿抽提一次；取上清，加入等體積異丙醇，4℃放置10min以上，12000r/m離心10min，棄上清；70％乙醇洗滌1～2次，晾干后，加入100μl?te緩沖液溶解核酸，4℃保存備用。也可用相應市售核酸提取試劑盒。
15、發菜富含膠質物、蛋白質和碳水化合物，其藻絲體外含有很厚的角質鞘，這些特征都增加了發菜基因組dna的提取難度。本實驗采用凱杰的核酸提取試劑dneasy?plant?minikit(69104)可有效提取到發菜的核酸。組氨酸激酶是由hk基因編碼的一個信號傳導酶家族，可以利用傳感器結構域感知外界環境信號并傳遞到細胞內，再由應答調節蛋白接受信號并啟動調節功能。
16、s02、引物與探針設計
17、在genbank中查找并獲得發菜基因序列cp024793.1，比對其同源性，選取同源性序列中的較保守區，采用primer?express?3.0軟件設計發菜的特異性引物和探針；
18、s03、實時熒光pcr擴增條件
19、real-time?pcr反應體系：probe?qpcr?master?mix(2×)10μl；
20、上游引物(10μmol/l)0.40μl；
21、下游引物(10μmol/l)0.40μl；
22、探針(10μmol/l)0.80μl；
23、rox?0.4μl；
24、dna模板4.0μl；
25、補水至20μl；
26、real-time?pcr的反應程序為：50℃2min；95℃10min；95℃15s，60℃30s，運行40個循環。
27、作為優選，步驟s03后還包括步驟s04；
28、s04、分別提取發菜、沼澤念珠藻、林氏念珠藻、海綿狀念珠藻、點形念珠藻、灰色念珠藻、喜鈣念珠藻、膠團念珠藻、池生念珠藻、葉狀念珠藻、普通念珠藻、擬球狀念珠藻樣本的dna，并對其進行real-time?pcr擴增檢測，檢測其反應體系的特異性；其中，反應條件與步驟s03相同。
29、作為優選，步驟s04后還包括步驟s05；
30、s05、取發菜的dna，測定其dna濃度，采用紫外分光光度法進行測量，對其dna進行10倍梯度稀釋，取不同濃度的dna模板分別進行實時熒光pcr檢測，得到對應濃度下的擴增曲線。
31、與現有技術相比，本專利技術的有益效果是：
32、(1)、組氨酸激酶是由hk基因編碼的一個信號傳導酶家族，可以利用傳感器結構域感知外界環境信號并傳遞到細胞內，再由應答調節蛋白接受信號并啟動調節功能。在生物體中，hk作為信號感受機制的重要組成部分，可以使生物體在一定程度上適應及響應各種脅迫。研究表明發菜hk基因與響應干旱脅迫有光。通過blast比較分析，發菜組氨酸激酶基因序列與念珠藻屬其他種類無相關性。本研究選取發菜hk基因序列設計開發了引物探針，通過該引物探針可將發菜與沼澤念珠藻、林氏念珠藻等其他11種念珠藻進行區分，表明其具有良好的特異性。
33、(2)同時，利用該方法對發菜真偽進行檢測限量為5.3×10-4ng/μl，具有很好的靈敏度。本方法的建立有助于規范進出口發菜的監管，并可鑒定發菜的真偽，提高其鑒定準確率，為口岸精準、快速的鑒定提供了標準依據。
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1.一種特異性引物NF1，其特征在于：
2.一種引物探針組，其特征在于包括權利要求1所述的特異性引物NF1和探針NF1-P，所述探針NF1-P的核苷酸序列為：5′-FAM?-CCCACTGCCCAGCGCCTGTTC-TAMRA-3′。
3.根據權利要求2所述引物探針組，其特征在于所述探針NF1-P的5′端為FAM熒光報告基團，3′端的淬滅基團為Eclipse。
4.根據權利要求1所述特異引物或權利要求2或3所述引物探針組的應用為：發菜及其發菜制品的真偽鑒定。
5.一種用于發菜真偽鑒定實時熒光PCR檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：
6.一種用于發菜真偽鑒定實時熒光PCR檢測方法，其特征在于，步驟S03后還包括步驟S04；
7.一種用于發菜真偽鑒定實時熒光PCR檢測方法，其特征在于，步驟S04后還包括步驟S05；
【技術特征摘要】
1.一種特異性引物nf1，其特征在于：
2.一種引物探針組，其特征在于包括權利要求1所述的特異性引物nf1和探針nf1-p，所述探針nf1-p的核苷酸序列為：5′-fam?-cccactgcccagcgcctgttc-tamra-3′。
3.根據權利要求2所述引物探針組，其特征在于所述探針nf1-p的5′端為fam熒光報告基團，3′端的淬滅基團為eclipse。
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