【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物檢測，具體涉及一套檢測馬健康情況的引物集合和微流控芯片。
技術介紹
1、亨德拉病毒(hendravirus，hev)屬于亨德拉病毒是屬于副黏液病毒科，受亨德拉病毒感染的病馬會出現發燒、呼吸困難、面部腫脹、行動遲緩等癥狀，有的甚至口鼻出血，幾天之內，死亡，人感染了也會因腎衰竭，呼吸系統會受到影響然后無法呼吸導致死亡。
2、尼帕病毒(nipah?virus，nvd)是一新型人獸共患病毒，它是rna病毒，屬于副粘病毒科，能引起廣泛的血管炎，感染者有發熱、嚴重頭痛、腦膜炎等癥狀，給人及動物帶來嚴重危害。
3、水泡性口炎(vesicular?stomatitis?virus，vsv)，本病是馬、牛和豬的一種病毒性疾病。其特征為口腔粘膜、乳頭皮膚及蹄冠部皮膚出現水泡及糜爛，但很少發生死亡。感染這種病毒的馬可能會發燒、進食困難、體重減輕或變得跛腳。感染的動物一般在一周后康復。最常見的并發癥是局部繼發細菌和真菌感染，以及乳房炎等。
4、馬傳染性子宮炎(contagious?equine?metritis，cea)是革蘭氏陰性微嗜氣性泰勒桿菌引起的一種主要通過交配傳播的馬屬動物傳染病，主要危害繁殖母馬，以發生子宮頸炎、子宮內膜炎及陰道炎為特征，公馬感染后無臨床癥狀。隱性感染的繁殖母馬和種公馬是傳染源。除交配感染外，也可經污染物發生間接接觸傳染。公馬在交配時尿道生殖道粘膜感染本菌后,可導致長達數月乃至數年的帶菌狀態。
5、傳統的上述病毒檢測方法主要包括采用傳統培養基法(病原微生物分離
技術實現思路
1、本專利技術提供了一套檢測馬健康情況的引物集合和微流控芯片，可同時完成亨德拉病毒、尼帕病毒、水泡性口炎病毒和馬傳染性子宮炎病毒的檢測，準確性高、靈敏度高、特異性強。
2、本專利技術提供了一套檢測馬健康情況的引物集合，包括針對亨德拉病毒、尼帕病毒、水泡性口炎病毒和馬傳染性子宮炎病毒設計的lamp引物組。
3、優選的，包括分別針對亨德拉病毒、尼帕病毒、水泡性口炎病毒和馬傳染性子宮炎病毒的seq?id?no.25～seq?id?no.28所示的序列設計所述lamp引物組。
4、優選的，針對亨德拉病毒設計的lamp引物組包括核苷酸序列依次如seq?id?no.1～seq?id?no.6所示的正向外引物hev-f3、反向外引物hev-b3、正向內引物hev-fip、反向內引物hev-bip、正向環引物hev-lf和反向環引物hev-lb；
5、針對尼帕病毒設計的lamp引物組包括核苷酸序列依次如seq?id?no.7～seq?idno.12所示的正向外引物nvd-f3、反向外引物nvd-b3、正向內引物nvd-fip、反向內引物nvd-bip、正向環引物nvd-lf和反向環引物nvd-lb；
6、針對水泡性口炎病毒設計的lamp引物組包括核苷酸序列依次如seq?id?no.13～seq?id?no.18所示的正向外引物vsv-f3、反向外引物vsv-b3、正向內引物vsv-fip、反向內引物vsv-bip、正向環引物vsv-lf和反向環引物vsv-lb；
7、針對馬傳染性子宮炎病毒設計的lamp引物組包括核苷酸序列依次如seq?idno.19～seq?id?no.24所示的正向外引物cem-f3、反向外引物cem-b3、正向內引物cem-fip、反向內引物cem-bip、正向環引物cem-lf和反向環引物cem-lb。
8、優選的，針對每種病毒設計的lamp引物組中，正向外引物的濃度為0.1～1μm，反向外引物的濃度為0.1～5μm，正向內引物和反向內引物的濃度均為0.1～5μm，正向環引物和反向環引物的濃度均為0.1～3μm。
9、優選的，針對每種病毒設計的lamp引物組中，正向外引物的濃度為0.3～0.5μm，反向外引物的濃度為1～2μm，正向內引物和反向內引物的濃度均為2.4～3.4μm，正向環引物和反向環引物的濃度均為1～2μm。
10、本專利技術還提供了上述引物集合在制備同時檢測亨德拉病毒、尼帕病毒、水泡性口炎病毒和馬傳染性子宮炎病毒的工具中的應用。
11、優選的，所述工具包括微流控芯片。
12、本專利技術還提供了一種同時檢測亨德拉病毒、尼帕病毒、水泡性口炎病毒和馬傳染性子宮炎病毒的微流控芯片，在所述微流控芯片的反應孔中分別配制針對不同病毒的lamp反應體系；
13、每種病毒的lamp反應體系以25μl計，包括：凍干體系mix，正向外引物的濃度為0.1～1μm，反向外引物的濃度為0.1～5μm，正向內引物和反向內引物的濃度均為0.1～5μm，正向環引物和反向環引物的濃度均為0.1～3μm。
14、優選的，所述微流控芯片包括8個反應孔。
15、本專利技術還提供了一種同時檢測亨德拉病毒、尼帕病毒、水泡性口炎病毒和馬傳染性子宮炎病毒的試劑盒，包括上述微流控芯片。
16、優選的，利用所述微流控芯片進行檢測時，以口鼻拭子或生殖道拭子提取的dna為模板。
17、有益效果：本專利技術提供了一套檢測馬健康情況的引物集合，包括針對亨德拉病毒、尼帕病毒、水泡性口炎病毒和馬傳染性子宮炎病毒設計的lamp引物組，針對每種病毒分別設計一對外引物、一對內引物和一對環引物，由于環引物的加入，極大地加速了反應的進程，縮短了反應所需的時間，能夠在30min內檢出10個拷貝的病毒核酸。
18、本專利技術所述引物集合可與微流控芯片結合，僅通過熒光值變化就可進行判定，從而實現對亨德拉病毒、尼帕病毒、水泡性口炎病毒、馬傳染性子宮炎病毒的快速檢測，準確性高、靈敏度高、特異性強。利用本專利技術所述方法進行同時檢測時，整個反應過程不需要開蓋，極大地減少了污染的可能性，具有現場應用的前景。
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1.一套檢測馬健康情況的引物集合，其特征在于，包括針對亨德拉病毒、尼帕病毒、水泡性口炎病毒和馬傳染性子宮炎病毒設計的LAMP引物組。
2.根據權利要求1所述引物集合，其特征在于，包括分別針對亨德拉病毒、尼帕病毒、水泡性口炎病毒和馬傳染性子宮炎病毒的SEQ?ID?No.25～SEQ?IDNo.28所示的序列設計所述LAMP引物組。
3.根據權利要求1或2所述引物集合，其特征在于，針對亨德拉病毒設計的LAMP引物組包括核苷酸序列依次如SEQ?ID?No.1～SEQ?ID?No.6所示的正向外引物HeV-F3、反向外引物HeV-B3、正向內引物HeV-FIP、反向內引物HeV-BIP、正向環引物HeV-LF和反向環引物HeV-LB；
4.根據權利要求3所述引物集合，其特征在于，針對每種病毒設計的LAMP引物組中，正向外引物的濃度為0.1～1μM，反向外引物的濃度為0.1～5μM，正向內引物和反向內引物的濃度均為0.1～5μM，正向環引物和反向環引物的濃度均為0.1～3μM。
5.權利要求1～4任一項所述引物集合在制備同時檢測亨德拉病毒、尼
6.根據權利要求5所述應用，其特征在于，所述工具包括微流控芯片。
7.一種同時檢測亨德拉病毒、尼帕病毒、水泡性口炎病毒和馬傳染性子宮炎病毒的微流控芯片，其特征在于，在所述微流控芯片的反應孔中分別配制針對不同病毒的LAMP反應體系；
8.根據權利要求7所述微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片包括8個反應孔。
9.一種同時檢測亨德拉病毒、尼帕病毒、水泡性口炎病毒和馬傳染性子宮炎病毒的試劑盒，其特征在于，包括權利要求7或8所述微流控芯片。
10.根據權利要求9所述試劑盒，其特征在于，利用所述微流控芯片進行檢測時，以口鼻拭子或生殖道拭子中提取的基因組DNA為模板。
...【技術特征摘要】
1.一套檢測馬健康情況的引物集合，其特征在于，包括針對亨德拉病毒、尼帕病毒、水泡性口炎病毒和馬傳染性子宮炎病毒設計的lamp引物組。
2.根據權利要求1所述引物集合，其特征在于，包括分別針對亨德拉病毒、尼帕病毒、水泡性口炎病毒和馬傳染性子宮炎病毒的seq?id?no.25～seq?idno.28所示的序列設計所述lamp引物組。
3.根據權利要求1或2所述引物集合，其特征在于，針對亨德拉病毒設計的lamp引物組包括核苷酸序列依次如seq?id?no.1～seq?id?no.6所示的正向外引物hev-f3、反向外引物hev-b3、正向內引物hev-fip、反向內引物hev-bip、正向環引物hev-lf和反向環引物hev-lb；
4.根據權利要求3所述引物集合，其特征在于，針對每種病毒設計的lamp引物組中，正向外引物的濃度為0.1～1μm，反向外引物的濃度為0.1～5μm，正向內引物和反向內引...
【專利技術屬性】
技術研發人員：薛青紅，秦義嫻，蘇佳，高金源，王兆麗，吳華偉，孫淼，高月異，
申請(專利權)人：中國獸醫藥品監察所，
類型：發明
國別省市：
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