【技術實現步驟摘要】
本申請屬于活細胞中蛋白質相互作用的熒光成像，具體涉及一種雙分子熒光互補系統的開發和應用。
技術介紹
1、蛋白質-蛋白質相互作用以及蛋白質-核酸相互作用是許多細胞內生物過程的基礎。研究這些生物大分子間的相互作用不僅有助于從分子層面理解細胞生理機制，也是發現許多新藥靶點的有效手段。幾十年來，已經有許多研究蛋白質-蛋白質相互作用的技術被開發，如熒光共振能量轉移(fluorescence?resonance?energy?transfer)、免疫共沉淀(co-immunoprecipitation)和酵母雙雜交(yeast?two-hybrid?assay)等，它們各自有著不同的優勢，卻也都存在一些方面的局限性。在諸多技術中，雙分子熒光互補技術(bimolecular?fluorescence?complementation,bifc)作為一種能在生理條件下原位直接觀察蛋白質-蛋白質相互作用的方法而受到研究人員青睞。
2、綠色熒光蛋白(greenfluorescent?protein，簡稱gfp)等熒光蛋白由β折疊片組成的桶狀結構及桶中央幾個氨基酸組成的發色團組成，雙分子熒光互補技術涉及到熒光蛋白的拆分和重組：將熒光蛋白分為n端和c端，再分別與兩種待測蛋白融合表達，如果兩種待測蛋白間確實存在相互作用，那么與之共價連接的熒光蛋白n端和c端也會由于空間臨近而重組成完整的熒光蛋白結構并發出熒光。雙分子熒光互補技術的優勢在于其操作簡便、靈敏度高以及能檢測弱相互作用及瞬時相互作用等。十幾年間，已經有越來越多的熒光蛋白被應用于雙分子熒光
3、在紅色熒光蛋白中，目前已經開發過基于mrfp1-q66t、mcherry、mscarlet?i的雙分子熒光互補系統，然而，由于這些熒光蛋白各自在性能上的缺陷，由其開發的雙分子熒光互補系統也會在一些方面表現出不足。例如mrfp1-q66t、mcherry等較早被開發的rfp存在量子產率較低、光致變色性或殘留的二聚化趨勢等問題，這在一定程度上可能會降低檢測的信噪比。mscarlet系列的初代蛋白固有亮度高，無光致變色性，且為完全的單體rfp，但其也存在成熟時間相對較慢的問題，這可能會導致雙分子熒光互補中觀察到的熒光的亞細胞定位與蛋白實際相互作用不完全吻合。初代mscarlet的變體mscarlet?i在成熟時間和成熟程度上有了較大改良，但固有亮度低于初代mscarlet蛋白。因此，針對現有的雙分子熒光互補系統中存在的假陽性、亮度弱、成熟時間慢等問題，提出本申請。
技術實現思路
1、本申請的第一個目的在于提供一種基于紅色熒光蛋白mscarlet3的雙分子熒光互補系統，克服現有技術中存在的假陽性、亮度弱、成熟時間慢的問題。
2、為實現前述專利技術目的，本申請采用的技術方案包括：
3、一種基于紅色熒光蛋白mscarlet3的雙分子熒光互補系統，包括第一載體和第二載體；紅色熒光蛋白mscarlet3是由229個氨基酸構成的蛋白，紅色熒光蛋白mscarlet3的氨基酸序列如序列seq?id?no.1所示；第一載體為包含有用于表達第一蛋白片段的基因序列的載體，第二載體為包含有用于表達第二蛋白片段的基因序列的載體，當第一蛋白片段和第二蛋白片段相互靠近時，可重構形成紅色熒光蛋白mscarlet3；其中：第一蛋白片段為由紅色熒光蛋白mscarlet3的第1號位至第n號位氨基酸構成的蛋白片段，第二蛋白片段為由紅色熒光蛋白mscarlet3的第(n+1)號位至第229號位氨基酸構成的蛋白片段；n為154或169。
4、在一些實施例中，當n為154時，第一蛋白片段為msc154n蛋白片段，第二蛋白片段為msc155c蛋白片段；用于表達msc154n的基因序列包含有基因序列seq?id?no.3且用于表達msc155c蛋白片段的基因序列包含有基因序列seq?id?no.4。
5、在另一些實施例中，當n為169時，第一蛋白片段為msc169n蛋白片段，第二蛋白片段為msc170c蛋白片段；用于表達msc169n蛋白片段的基因序列包含有基因序列seq?idno.5且用于表達msc170c蛋白片段的基因序列包含有基因序列seq?id?no.6。
6、進一步地，第一載體進一步包括第一基因序列，第一基因序列用于表達第一待測蛋白，第一載體用于表達第一融合蛋白，第一融合蛋白為第一待測蛋白與第一蛋白片段的融合蛋白。第二載體進一步包括第二基因序列，第二基因序列用于表達第二待測蛋白，第二載體用于表達第二融合蛋白，第二融合蛋白為所述第二蛋白與第二蛋白片段的融合蛋白。
7、本申請的第二個目的在于提供基于紅色熒光蛋白mscarlet3的雙分子熒光互補系統的構建方法，包括如下步驟：
8、s1：將紅色熒光蛋白mscarlet3的基因序列克隆在第一真核表達載體上，合成含有mscarlet3的基因載體；
9、s2：以含有mscarlet3的基因載體為模板，通過聚合酶鏈式反應得到用于表達第一蛋白片段的基因序列和用于表達第二蛋白片段的基因序列；
10、s3：使用重組酶將用于表達第一蛋白片段的基因序列插入到第二真核表達載體中，構成第一載體；使用重組酶將用于表達第二蛋白片段的基因序列插入到第三真核表達載體中，構成第二載體；
11、其中，紅色熒光蛋白mscarlet3由229個氨基酸組成，其氨基酸序列如序列seq?idno1所示，基因序列如序列seq?id?no2所示；當第一蛋白片段和第二蛋白片段相互靠近時，可重構形成紅色熒光蛋白mscarlet3；其中：第一蛋白片段為由紅色熒光蛋白mscarlet3的第1號位至第n號位氨基酸構成的蛋白片段，第二蛋白片段為由所述紅色熒光蛋白mscarlet3的第(n+1)號位至第229號位氨基酸構成的蛋白片段；n為154或169。
12、進一步地，第一真核表達載體包括pcdna3.1(+)載體、puc57、puc19中的一種；第二真核表達載體包括pcdna3.1(+)載體、puc57、puc19中的一種；第三真核表達載體包括pcdna3.1(+)載體、puc57、puc19中的一種。
13、在一些實施例中，第一真核表達載體為pcdna3.1(+)載體，含有mscarlet3的基因載體為pcdna3.1-mscarlet3；用于表達msc154n的基因序列為基因序列seq?id?no.3且用于表達msc155c蛋白片段的基因序列為基因序列seq?id?no.4；步驟s2中：
14、以pcdna3.1-mscarlet3為模板，通過聚合酶鏈式反應得到基因序列seq?id?no.3時，
15、上游引物為：
16、5’-acccaagctggctagccaccatggatagcaccgaggcagt-3’
17、下游引物為：
18、5’-acgggccct本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種基于紅色熒光蛋白mScarlet3的雙分子熒光互補系統，其特征在于：包括第一載體和第二載體；所述紅色熒光蛋白mScarlet3是由229個氨基酸構成的蛋白，所述紅色熒光蛋白mScarlet3的氨基酸序列如序列SEQ?ID?NO.1所示；所述第一載體為包含有用于表達第一蛋白片段的基因序列的載體，所述第二載體為包含有用于表達第二蛋白片段的基因序列的載體，當所述第一蛋白片段和第二蛋白片段相互靠近時，可重構形成所述紅色熒光蛋白mScarlet3；其中：所述第一蛋白片段為由所述紅色熒光蛋白mScarlet3的第1號位至第n號位氨基酸構成的蛋白片段，所述第二蛋白片段為由所述紅色熒光蛋白mScarlet3的第(n+1)號位至第229號位氨基酸構成的蛋白片段；n為154或169。
2.根據權利要求1所述的基于紅色熒光蛋白mScarlet3的雙分子熒光互補系統，其特征在于：當n為154時，所述第一蛋白片段為mSc154N蛋白片段，所述第二蛋白片段為mSc155C蛋白片段；所述用于表達mSc154N的基因序列包含有基因序列SEQ?ID?NO.3且所述用于表達mSc155C蛋白片段
3.根據權利要求1所述的基于紅色熒光蛋白mScarlet3的雙分子熒光互補系統，其特征在于：所述第一載體進一步包括第一基因序列，所述第一基因序列用于表達第一待測蛋白，所述第一載體用于表達第一融合蛋白，所述第一融合蛋白為所述第一待測蛋白與所述第一蛋白片段的融合蛋白。
4.根據權利要求1所述的基于紅色熒光蛋白mScarlet3的雙分子熒光互補系統，其特征在于：所述第二載體進一步包括第二基因序列，所述第二基因序列用于表達第二待測蛋白，所述第二載體用于表達第二融合蛋白，所述第二融合蛋白為所述第二蛋白與所述第二蛋白片段的融合蛋白。
5.一種基于紅色熒光蛋白mScarlet3的雙分子熒光互補系統的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：
6.根據權利要求5所述的基于紅色熒光蛋白mScarlet3的雙分子熒光互補系統的構建方法，其特征在于，所述第一真核表達載體包括pcDNA3.1(+)載體、pUC57、pUC19中的一種；所述第二真核表達載體包括pcDNA3.1(+)載體、pUC57、pUC19中的一種；所述第三真核表達載體包括pcDNA3.1(+)載體、pUC57、pUC19中的一種。
7.根據權利要求5所述的基于紅色熒光蛋白mScarlet3的雙分子熒光互補系統的構建方法，其特征在于，所述第一真核表達載體為pcDNA3.1(+)載體，所述含有mScarlet3的基因載體為pcDNA3.1-mScarlet3；所述用于表達mSc154N的基因序列為基因序列SEQ?ID?NO.3且所述用于表達mSc155C蛋白片段的基因序列為基因序列SEQ?ID?NO.4；所述步驟S2中：
8.根據權利要求5所述的基于紅色熒光蛋白mScarlet3的雙分子熒光互補系統的構建方法，其特征在于，所述第一真核表達載體為pcDNA3.1(+)載體，所述含有mScarlet3的基因載體為pcDNA3.1-mScarlet3；所述用于表達mSc169N的基因序列為基因序列SEQ?IDNO.5且所述用于表達mSc170C蛋白片段的基因序列為基因序列SEQ?ID?NO.6；所述步驟S2中：
9.一種如權利要求1～4中的任意一項所述的基于紅色熒光蛋白mScarlet3的雙分子熒光互補系統在蛋白質間相互作用的成像應用。
10.如權利要求9所述的應用，其特征在于，包括如下步驟：
...【技術特征摘要】
1.一種基于紅色熒光蛋白mscarlet3的雙分子熒光互補系統，其特征在于：包括第一載體和第二載體；所述紅色熒光蛋白mscarlet3是由229個氨基酸構成的蛋白，所述紅色熒光蛋白mscarlet3的氨基酸序列如序列seq?id?no.1所示；所述第一載體為包含有用于表達第一蛋白片段的基因序列的載體，所述第二載體為包含有用于表達第二蛋白片段的基因序列的載體，當所述第一蛋白片段和第二蛋白片段相互靠近時，可重構形成所述紅色熒光蛋白mscarlet3；其中：所述第一蛋白片段為由所述紅色熒光蛋白mscarlet3的第1號位至第n號位氨基酸構成的蛋白片段，所述第二蛋白片段為由所述紅色熒光蛋白mscarlet3的第(n+1)號位至第229號位氨基酸構成的蛋白片段；n為154或169。
2.根據權利要求1所述的基于紅色熒光蛋白mscarlet3的雙分子熒光互補系統，其特征在于：當n為154時，所述第一蛋白片段為msc154n蛋白片段，所述第二蛋白片段為msc155c蛋白片段；所述用于表達msc154n的基因序列包含有基因序列seq?id?no.3且所述用于表達msc155c蛋白片段的基因序列包含有基因序列seq?id?no.4；當n為169時，所述第一蛋白片段為msc169n蛋白片段，所述第二蛋白片段為msc170c蛋白片段；所述用于表達msc169n蛋白片段的基因序列包含有基因序列seq?id?no.5且所述用于表達msc170c蛋白片段的基因序列包含有基因序列seq?id?no.6。
3.根據權利要求1所述的基于紅色熒光蛋白mscarlet3的雙分子熒光互補系統，其特征在于：所述第一載體進一步包括第一基因序列，所述第一基因序列用于表達第一待測蛋白，所述第一載體用于表達第一融合蛋白，所述第一融合蛋白為所述第一待測蛋白與所述第一蛋白片段的融合蛋白。
4.根據權利要求1所述的基于紅色熒光蛋白mscarlet3的雙分子熒光互補系統，其...
【專利技術屬性】
技術研發人員：甘海云，岳震，張洋，
申請(專利權)人：中國科學院深圳先進技術研究院，
類型：發明
國別省市：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。