【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
專利
本專利技術(shù)提供了重組工程化的去泛素化酶（dub）和用于治療或緩解受試者中的遺傳性離子通道病，例如長qt綜合征、brugada綜合征或囊性纖維化的方法等。本文還提供了用于從導(dǎo)致這類遺傳性離子通道病的突變中篩選出可通過上文公開的重組工程化的dub治療的運(yùn)輸缺陷突變的方法。
技術(shù)介紹
0、專利技術(shù)背景
1、包括離子通道、轉(zhuǎn)運(yùn)體和受體在內(nèi)的整合表面膜蛋白對所有細(xì)胞的生存和功能至關(guān)重要。因此，控制膜蛋白的表面豐度和組成的過程是細(xì)胞生物學(xué)和生理學(xué)的關(guān)鍵決定因素。膜蛋白的表面運(yùn)輸受損是從囊性纖維化到心律失常的多種疾病的基礎(chǔ)（gelman?&kopito,?2002；anderson等人，2014），激發(fā)了對更好地理解控制膜蛋白表面密度的基本機(jī)制的需求。膜蛋白的表面儲庫受多層成熟和運(yùn)輸過程的調(diào)控；從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（er）中的適當(dāng)折疊開始，在高爾基體中翻譯后成熟，遞送到表面并在表面持續(xù)優(yōu)化，并且最終在溶酶體中將其去除和降解（macgurn等人，2012；foot等人，2017）。對控制膜蛋白命運(yùn)的這些不同方面的機(jī)制的基本了解是一個重要且大量研究的研究領(lǐng)域。
2、泛素化是一種強(qiáng)大的機(jī)制，能夠通過調(diào)控膜蛋白生命周期中的多個步驟來調(diào)整膜蛋白的功能性表達(dá)。泛素是76個殘基的蛋白質(zhì)，可以通過三種酶的順序作用與多肽底物上的賴氨酸殘基共價附著：泛素激活酶（e1）；泛素綴合酶（e2）；和泛素連接酶（e3），其催化泛素向底物的轉(zhuǎn)移。人類基因組編碼2種e1、37種e2和>?600種e3泛素連接酶。泛素包含7個賴氨酸殘基（k6
3、去泛素化酶（dub）是特化的異肽酶（isopeptidase），其通過修飾和去除泛素鏈為泛素信號傳導(dǎo)提供突出性質(zhì)。有超過100種人dub，包括6個不同的家族：1）泛素特異性蛋白酶（usp）家族，2）卵巢腫瘤蛋白酶（out）家族，3）泛素c末端水解酶（uch）家族，4）約瑟芬結(jié)構(gòu)域家族（josephin），5）包含與泛素相互作用的基序的新型dub家族（mindy），以及6）jab1/mpn/mov34金屬酶結(jié)構(gòu)域家族（jamm）。值得注意的是，usp家族是相對混雜的，水解所有泛素連接，與otu家族形成鮮明對比，otu家族包含具有不同連接偏好的多組酶。連接特異性dub最近已經(jīng)純化并用于無細(xì)胞體外測定法，作為在western印跡上運(yùn)行靶蛋白質(zhì)之前診斷鏈特異性的方式。此外，純化的連接特異性dub已用于蝕刻（sculpt）更多的非典型泛素鏈以用于分離和結(jié)構(gòu)分析。
4、遺傳性離子通道病是罕見疾病，涵蓋神經(jīng)系統(tǒng)（癲癇、偏頭痛、神經(jīng)性疼痛）、心血管系統(tǒng)（長qt綜合征、brugada綜合征）、呼吸系統(tǒng)（囊性纖維化）、內(nèi)分泌系統(tǒng)（糖尿病、高胰島素血性低血糖癥）和泌尿系統(tǒng)（bartter綜合征、尿崩癥）中的廣泛病癥。下一代基因組測序領(lǐng)域的快速擴(kuò)展領(lǐng)域已經(jīng)揭示了數(shù)千種具有多種潛在機(jī)制的通道突變。了解功能喪失的根本原因?qū)τ诓捎脗€性化策略治療每種疾病至關(guān)重要。這些大量的遺傳性突變導(dǎo)致通道在運(yùn)輸至表面膜方面存在缺陷。例如，囊性纖維化是高加索人最常見的致命遺傳病，它是由于囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)子（cftr）（一種氯離子通道）的缺陷引起的。研究最多的突變（δf508）占所有病例的?85%，并引起通道錯誤折疊和泛素依賴性運(yùn)輸缺陷。在長qt綜合征的情況中，兩個通道（kcnq1、herg）中的500多個突變占所有遺傳性病例的近90%。這兩個通道中的運(yùn)輸缺陷是大多數(shù)致病突變的機(jī)制基礎(chǔ)。建立一個高通量篩選此類致病突變以診斷潛在病理機(jī)制的平臺將是有益的。這種診斷能力將為特定突變的最佳治療選擇提供信息，從而為這些罕見疾病開發(fā)個性化藥物。本文提供的專利技術(shù)涉及這樣的平臺。此外，本專利技術(shù)還為基因療法和靶向糾正發(fā)現(xiàn)的泛素依賴性運(yùn)輸缺陷提供了新的治療機(jī)會。
5、此外，最近的埃博拉疫情和耐藥性“超級細(xì)菌”的出現(xiàn)揭示出越來越需要快速、可推廣的方法來控制和限制感染的傳播。傳染性病原體利用宿主細(xì)胞的泛素化過程來傳播和擴(kuò)散疾病。特別是，已經(jīng)顯示病毒在其生命周期的每個方面利用泛素：病毒進(jìn)入，復(fù)制和出芽。跨病毒家族中，許多病毒含有帶有py基序的蛋白質(zhì)，其允許募集宿主泛素e3連接酶。本專利技術(shù)利用這一保守機(jī)制提供了可推廣的方法，從而選擇性地靶向不同的感染過程。實(shí)際上，本專利技術(shù)能夠?qū)共《緦S持感染所需的泛素化的依賴，并提供了模塊化的和可轉(zhuǎn)移的方法來對抗新出現(xiàn)的、危及生命的和/或慢性感染。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
0、專利技術(shù)概述
1、本專利技術(shù)提供了重組工程化的去泛素化酶（dub），其包含：
2、a）催化單元；
3、b）蛋白結(jié)合子；和
4、c）所述催化單元與所述蛋白結(jié)合子之間的可變接頭。
5、本專利技術(shù)還提供了在受試者中治療或緩解遺傳性離子通道病的作用的方法，其包括向所述受試者施用編碼上述重組工程化的dub的核酸。
6、本專利技術(shù)還提供了從導(dǎo)致遺傳性離子通道病的突變中篩選出可通過上述重組工程化的dub治療的運(yùn)輸缺陷突變的方法，其包括以下步驟:
7、a）在表達(dá)導(dǎo)致遺傳性離子通道病的突變的細(xì)胞中，測量突變體通道的表面密度和/或總表達(dá)；
8、b）如果該突變體通道的表面密度和/或總表達(dá)相對于野生型（wt）通道降低，則測定該突變體通道的泛素化狀態(tài)；
9、c）基于該突變體通道的泛素化狀態(tài)，選擇上述重組工程化的dub并使其與該突變共表達(dá)，然后測量在具有共表達(dá)的細(xì)胞中突變體通道的表面密度和/或總表達(dá)；和
10、d）如果步驟（c）中突變體通道的表面密度和/或總表達(dá)相對于wt通道恢復(fù)了，則將該突變鑒定為可治療的。
11、本專利技術(shù)還提供了在受試者中治療或緩解急性/慢性病毒感染的作用的方法，其包括向該受試者施用編碼上述重組工程化的dub的核酸。
12、本專利技術(shù)還提供了重組表達(dá)載體，其包含編碼上述重組工程化的dub的核酸，并且還提供了用所述載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
本文檔來自技高網(wǎng)...【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種重組工程化的去泛素化酶（DUB），其包含：
2.權(quán)利要求1的重組工程化的DUB，其中所述催化單元是選擇性的或非選擇性的。
3.權(quán)利要求1的重組工程化的DUB，其中所述催化單元包含選自以下的去泛素化酶的催化結(jié)構(gòu)域：泛素特異性蛋白酶（USP）家族、卵巢腫瘤蛋白酶（OTU）家族、泛素C末端水解酶（UCH）家族、約瑟芬結(jié)構(gòu)域家族（Josephin）、含有與泛素相互作用的基序的新型DUB家族（MINDY）和JAB1/MPN/Mov34金屬酶結(jié)構(gòu)域家族（JAMM）。
4.權(quán)利要求3的重組工程化的DUB，其中所述催化單元包含來自USP家族的去泛素化酶的催化結(jié)構(gòu)域。
5.權(quán)利要求4的重組工程化的DUB，其中所述催化單元包含USP21的催化結(jié)構(gòu)域。
6.權(quán)利要求3的重組工程化的DUB，其中所述催化單元包含來自O(shè)TU家族的去泛素化酶的催化結(jié)構(gòu)域。
7.權(quán)利要求6的重組工程化的DUB，其中所述催化單元包含OTUD1的催化結(jié)構(gòu)域。
8.權(quán)利要求6的重組工程化的DUB，其中所述催化單元包含OTUD4的催化結(jié)構(gòu)域。<...
【技術(shù)特征摘要】
1.一種重組工程化的去泛素化酶（dub），其包含：
2.權(quán)利要求1的重組工程化的dub，其中所述催化單元是選擇性的或非選擇性的。
3.權(quán)利要求1的重組工程化的dub，其中所述催化單元包含選自以下的去泛素化酶的催化結(jié)構(gòu)域：泛素特異性蛋白酶（usp）家族、卵巢腫瘤蛋白酶（otu）家族、泛素c末端水解酶（uch）家族、約瑟芬結(jié)構(gòu)域家族（josephin）、含有與泛素相互作用的基序的新型dub家族（mindy）和jab1/mpn/mov34金屬酶結(jié)構(gòu)域家族（jamm）。
4.權(quán)利要求3的重組工程化的dub，其中所述催化單元包含來自usp家族的去泛素化酶的催化結(jié)構(gòu)域。
5.權(quán)利要求4的重組工程化的dub，其中所述催化單元包含usp21的催化結(jié)構(gòu)域。
6.權(quán)利要求3的重組工程化的dub，其中所述催化單元包含來自otu家族的去泛素化酶的催化結(jié)構(gòu)域。
7.權(quán)利要求6的重組工程化的dub，其中所述催化單元包含otud1的催化結(jié)構(gòu)域。
8.權(quán)利要求6的重組工程化的dub，其中所述催化單元包含otud4的催化結(jié)構(gòu)域。
9.權(quán)利要求6的重組工程化的dub，其中所述催化單元包含cezanne的催化結(jié)構(gòu)域。
10.權(quán)利要求6的重組工程化的dub，其中所述催化單元包含trabid的催化結(jié)構(gòu)域。
11.權(quán)利要求6的重組工程化的dub，其中所述催化單元包含otulin的催化結(jié)構(gòu)域。
12.權(quán)利要求1的重組工程化的dub，其中所述蛋白質(zhì)結(jié)合子選自細(xì)胞內(nèi)抗體片段、scfv、納米抗體、抗體模擬物、單抗體、darpin、脂質(zhì)運(yùn)載蛋白和靶向序列。
13.權(quán)利要求12的重組工程化的dub，其中所述蛋白質(zhì)結(jié)合子是vhh4納米抗體。
14.權(quán)利要求1的重組工程化的dub，其中所述催化單元是usp21的催化結(jié)構(gòu)域，且所述蛋白質(zhì)結(jié)合子是vhh4納米抗體，并且所得的重組工程化的去泛素化酶（nanousp21）能夠非選擇性地消除所有連接類型。
15.權(quán)利要求1的重組工程化的dub，其中所述催化單元是otud1的催化結(jié)構(gòu)域，且所述蛋白質(zhì)結(jié)合子是vhh4納米抗體，并且所得的重組工程化的去泛素化酶（nanootud1）能夠選擇性地消除k63連接。
16.權(quán)利要求1的重組工程化的dub，其中所述催化單元是otud4的催化結(jié)構(gòu)域，且所述蛋白質(zhì)結(jié)合子是vhh4納米抗體，并且所得的重組工程化的去泛素化酶（nanootud4）能夠選擇性地消除k48連接。<...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：H·M·科萊克拉夫特，S·坎納，
申請(專利權(quán))人：紐約市哥倫比亞大學(xué)理事會，
類型：發(fā)明
國別省市：
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