【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本申請涉及分子生物學領域，具體涉及一種分離的核酸酶及其用途。本申請還具體涉及：一種編碼所述核酸酶的核酸及核酸構建體，一種引導rna及其核酸構建體，以及一種包含所述核酸酶的組合物、重組載體、重組宿主細胞和試劑盒。本申請還具體涉及：一種將雙鏈斷裂引入宿主細胞的靶基因的方法，一種缺失、替換或插入宿主細胞的靶基因的方法，以及一種獲得被缺失、替換或插入靶基因的宿主細胞的方法。本申請還具體涉及所述核酸酶、編碼所述核酸酶的核酸及核酸構建體、所述引導rna及其核酸構建體、所述組合物、所述重組載體、或所述重組宿主細胞在將雙鏈斷裂引入宿主細胞的靶基因中的用途，在缺失、替換或插入宿主細胞的靶基因中的用途，在制備基因療法、細胞療法、基因組研究、干細胞誘導和誘導后分化的藥物或制劑中的用途。
技術介紹
1、隨著現代生物技術的高速發展，后基因組時代的來臨，人們正在從生物遺傳dna信息的讀取階段進入到遺傳信息的改寫甚至是重新設計的階段。crispr/cas9技術的發現使得基因編輯技術獲得了革命性的突破。crispr/cas9是由rna介導的靶向基因編輯工具，通過對sgrna的重編程可對不同內源dna序列進行特異識別和切割。cas9具有兩個核酸酶結構域——ruvc和hnh，它們分別負責dna任一鏈的切割。這些位點中的任一個發生突變可以使cas9轉化為單鏈cas9切口酶。堿基編輯和先導編輯等關于cas9的重要新技術都是基于cas9切口酶設計的。
2、然而，crispr/cas9的一些缺點限制了其應用：首先，spcas9的cds序列具有超過4.1kb的長
3、因此，后續出現了利用rna介導的內切核酸酶實現的基因編輯技術，即來自is200/is605家族的插入序列iscb和tnpb。它們廣泛分布于微生物中，并且擁有更為緊湊的蛋白結構，大小約400aa，不到spcas9的1/3，因此在酶的應用上具有更大的改造空間。tnpb是通過rerna(右元件rna(right?element?rna)，來源于isdra2轉座子中的re元件)介導去切割5’ttgat轉座子相關基序(tam)旁邊的dna，從而對基因組上的dna序列進行斷裂突變。tnpb的dna切割功能需要同時滿足兩個條件：(1)tam序列；(2)與靶基因匹配的位于rerna?3’端的序列。由于不同的核酸酶可識別不同的tam，因此更多高活性的核酸酶工具的挖掘及對其功能的驗證和檢測，可為基因編輯策略的開發提供更多更好的及靈活的選擇。
4、需要注意的是，在此部分中描述的方法不一定是之前已經設想到或采用的方法。除非另有指明，否則不應假定此部分中描述的任何方法僅因其包括在此部分中就被認為是現有技術。類似地，除非另有指明，否則此部分中提及的問題不應認為在任何現有技術中已被公認。
技術實現思路
1、為了解決上述問題，本申請旨在尋找蛋白分子量大小適宜同時具有較好基因編輯效應的rna介導的內切核酸酶，并為基因編輯提供更加多樣和特異的工具。
2、本申請提供了一種分離的核酸酶，其中該核酸酶包含下式所示的氨基酸序列：
3、(x1)(x2)a(x3)(x4)(x5)b(x6)(x7)c(x8)(x9)d(x10)(x11)e(x12)(x13)f(x14)(x15)g(x16)
4、其中，a、b、c、d、e、f、g為氨基酸數量；(x1)、(x3)、(x4)、(x6)、(x8)、(x10)、(x12)、(x14)、(x16)獨立地為極性氨基酸或脂肪族氨基酸；(x2)為任意的氨基酸，且a為15或16；(x5)為任意的氨基酸，且b為2；(x7)為任意的氨基酸，且c為2、3或4；(x9)為任意的氨基酸，且d為14、15、16、17或18；(x11)為任意的氨基酸，且e為1或2；(x13)為任意的氨基酸，且f為6；以及(x15)為任意的氨基酸，且g為5。
5、根據本申請的實施例，可以提供一種分離的核酸酶，其中該核酸酶具有選自下述(i)的核酸酶序列或(ii)-(iv)中的具有核酸酶活性的前述核酸酶的變體序列：(i)seq?idno:1-197中任一個所示的氨基酸序列中的至少一個；(ii)seq?id?no:1-197中任一個所示的氨基酸序列缺失、取代、插入或突變1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個氨基酸而獲得的序列中的至少一個；(iii)與seq?id?no:1-197中任一個所示的氨基酸序列具有至少70％、80％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列中的至少一個；以及(iv)seq?id?no:1-197中任一個所示的氨基酸序列進一步融合其他序列而獲得的序列中的至少一個。
6、根據本申請的實施例，可以提供一種引導rna，其中該引導rna包含rerna，該rerna包含seq?id?no:198-394中任一個所示的核苷酸序列或其變體，且該引導rna能夠與特定的核酸酶結合。
7、根據本申請的實施例，可以提供一種核酸，其中該核酸編碼本申請所述的核酸酶和/或本申請所述的引導rna。
8、根據本申請的實施例，可以提供一種核酸構建體，其包含本申請所述的核酸，還包含啟動子。
9、根據本申請的實施例，可以提供一種組合物，其中該組合物包含：is200/is605家族核酸酶或其功能片段，或包含編碼is200/is605家族核酸酶或其功能片段的核酸，所述核酸酶或其功能片段具有內切核酸酶活性；以及引導rna，或包含編碼引導rna的核酸，所述引導rna能與特定的核酸酶結合。
10、根據本申請的實施例，可以提供一種重組載體，其中該重組載體包含編碼本申請所述的核酸酶的核酸、本申請所述的引導rna、本申請所述的核酸、本申請所述的核酸構建體、或本申請所述的組合物。
11、根據本申請的實施例，可以提供一種重組宿主細胞，其中該重組宿主細胞包含本申請所述的核酸酶、本申請所述的引導rna、本申請所述的核酸、本申請所述的核酸構建體、本申請所述的組合物、或本申請所述的重組載體。
12、根據本申請的實施例，可以提供一種將雙鏈斷裂引入宿主細胞的靶基因的方法，其中該方法包括：將本申請所述的核酸酶、本申請所述的引導rna、本申請所述的核酸、本申請所述的核酸構建體、本申請所述的組合物、或本申請所述的重組載體遞送進本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種分離的核酸酶，其中所述核酸酶包含下式所示的氨基酸序列：
2.根據權利要求1所述的核酸酶，其中所述
3.根據權利要求2所述的核酸酶，其中所述(X1)為K。
4.根據權利要求2所述的核酸酶，其中所述(X3)為S或者T。
5.根據權利要求2所述的核酸酶，其中所述(X4)為S或者T。
6.根據權利要求2所述的核酸酶，其中所述(X6)為C。
7.根據權利要求2所述的核酸酶，其中所述(X8)為C。
8.根據權利要求2所述的核酸酶，其中所述(X10)為C。
9.根據權利要求2所述的核酸酶，其中所述(X12)為C。
10.根據權利要求2所述的核酸酶，其中所述(X14)為D。
11.根據權利要求2所述的核酸酶，其中所述(X16)為N。
12.一種分離的核酸酶，其中所述核酸酶具有選自下述(i)的核酸酶序列或(ii)-(iv)中的具有核酸酶活性的前述核酸酶的變體序列：
13.根據權利要求12所述的核酸酶，其中所述核酸酶具有選自下述組(1)-(9)中至少
14.根據權利要求12所述的核酸酶，其中所述核酸酶具有選自下述組(1)-(12)中至少一組的核酸酶序列：
15.根據權利要求1-14中任一項所述的核酸酶，其中所述核酸酶屬于IS200/IS605家族。
16.根據權利要求15所述的核酸酶，其中所述核酸酶屬于IS605、或IS1341亞家族。
17.根據權利要求1-14中任一項所述的核酸酶，其中所述核酸酶的物種來源包括細菌或古細菌。
18.根據權利要求17所述的核酸酶，其中所述核酸酶的物種來源包括放線菌門(Actinobacteria)、產水菌門(Aquificae)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、海綿桿菌門(Candidatus?Poribacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、藍細菌(Cyanobacteria)、奇球菌屬-棲熱菌屬(Deinococcus-Thermus)、厚壁菌門(Firmicutes)、浮霉菌門(Planctomycetes)、變形菌門(Proteobacteria)、螺旋體門(Spirochaetes)、軟壁菌門(Tenericutes)、熱袍菌門(Thermotogae)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、微古菌門(Candidatus?Micrarchaeota)、泉古菌門(Crenarchaeota)、或廣古菌門(Euryarchaeota)。
19.一種引導RNA，其中所述引導RNA包含reRNA，所述reRNA包含SEQ?ID?NO:198-394中任一個所示的核苷酸序列或其變體，且所述引導RNA能夠與特定的核酸酶結合。
20.根據權利要求19所述的引導RNA，其中所述reRNA包含與SEQ?ID?NO:198-394中任一個所示的核苷酸序列具有至少70％、80％、90％、95％或99％同一性的核苷酸序列中的至少一個。
21.根據權利要求20所述的引導RNA，其中所述reRNA包含SEQ?ID?NO:198-394中任一個所示的核苷酸序列中的至少一個。
22.根據權利要求21所述的引導RNA，其中所述reRNA為SEQ?ID?NO:198-394中任一個所示的核苷酸序列中的至少一個。
23.根據權利要求19-22中任一項所述的引導RNA，其中所述引導RNA還包含靶向序列，所述靶向序列能夠識別與轉座子相關基序相鄰的靶基因。
24.根據權利要求23所述的引導RNA，其中所述靶向序列的長度為10-50、10-40、10-30、或15-25個核苷酸中的至少一種。
25.根據權利要求23所述的引導RNA，其中所述轉座子相關基序包含下式所示的核苷酸序列：
26.一種核酸，其中所述核酸編碼根據權利要求1-18中任一項所述的核酸酶和/或權利要求19-25中任一項所述的引導RNA。
27.一種核酸構建體，其包含根據權利要求26所述的核酸。
28.根據權利要求27所述的核酸，其中所述核酸構建體包含啟動子，其中所述啟動子包括CMV、EF1a、SV40、PGK、UbC、人β肌動蛋白、CAG、TRE、UAS、Ac5、GFAP、多角體蛋白啟動子、TBG、ALB、ApoEHCR-hAAT、CaMKIIa、GAL1、TEF1、GDS、ADH1、CaMV35S、Ubi、H1、U6、T7、T7lac、Sp6、araBAD、trp、lac、Ptac、或pL。
【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】
1.一種分離的核酸酶，其中所述核酸酶包含下式所示的氨基酸序列：
2.根據權利要求1所述的核酸酶，其中所述
3.根據權利要求2所述的核酸酶，其中所述(x1)為k。
4.根據權利要求2所述的核酸酶，其中所述(x3)為s或者t。
5.根據權利要求2所述的核酸酶，其中所述(x4)為s或者t。
6.根據權利要求2所述的核酸酶，其中所述(x6)為c。
7.根據權利要求2所述的核酸酶，其中所述(x8)為c。
8.根據權利要求2所述的核酸酶，其中所述(x10)為c。
9.根據權利要求2所述的核酸酶，其中所述(x12)為c。
10.根據權利要求2所述的核酸酶，其中所述(x14)為d。
11.根據權利要求2所述的核酸酶，其中所述(x16)為n。
12.一種分離的核酸酶，其中所述核酸酶具有選自下述(i)的核酸酶序列或(ii)-(iv)中的具有核酸酶活性的前述核酸酶的變體序列：
13.根據權利要求12所述的核酸酶，其中所述核酸酶具有選自下述組(1)-(9)中至少一組的核酸酶序列：
14.根據權利要求12所述的核酸酶，其中所述核酸酶具有選自下述組(1)-(12)中至少一組的核酸酶序列：
15.根據權利要求1-14中任一項所述的核酸酶，其中所述核酸酶屬于is200/is605家族。
16.根據權利要求15所述的核酸酶，其中所述核酸酶屬于is605、或is1341亞家族。
17.根據權利要求1-14中任一項所述的核酸酶，其中所述核酸酶的物種來源包括細菌或古細菌。
18.根據權利要求17所述的核酸酶，其中所述核酸酶的物種來源包括放線菌門(actinobacteria)、產水菌門(aquificae)、擬桿菌門(bacteroidetes)、海綿桿菌門(candidatus?poribacteria)、綠彎菌門(chloroflexi)、藍細菌(cyanobacteria)、奇球菌屬-棲熱菌屬(deinococcus-thermus)、厚壁菌門(firmicutes)、浮霉菌門(planctomycetes)、變形菌門(proteobacteria)、螺旋體門(spirochaetes)、軟壁菌門(tenericutes)、熱袍菌門(thermotogae)、疣微菌門(verrucomicrobia)、微古菌門(candidatus?micrarchaeota)、泉古菌門(crenarchaeota)、或廣古菌門(euryarchaeota)。
19.一種引導rna，其中所述引導rna包含rerna，所述rerna包含seq?id?no:198-394中任一個所示的核苷酸序列或其變體，且所述引導rna能夠與特定的核酸酶結合。
20.根據權利要求19所述的引導rna，其中所述rerna包含與seq?id?no:198-394中任一個所示的核苷酸序列具有至少70％、80％、90％、95％或99％同一性的核苷酸序列中的至少一個。
21.根據權利要求20所述的引導rna，其中所述rerna包含seq?id?no:198-394中任一個所示的核苷酸序列中的至少一個。
22.根據權利要求21所述的引導rna，其中所述rerna為seq?id?no:198-394中任一個所示的核苷酸序列中的至少一個。
23.根據權利要求19-22中任一項所述的引導rna，其中所述引導rna還包含靶向序列，所述靶向序列能夠識別與轉座子相關基序相鄰的靶基因。
24.根據權利要求23所述的引導rna，其中所述靶向序列的長度為10-50、10-40、10-30、或15-25個核苷酸中的至少一種。
25.根據權利要求23所述的引導rna，其中所述轉座子相關基序包含下式所示的核苷酸序列：
26.一種核酸，其中所述核酸編碼根據權利要求1-18中任一項所述的核酸酶和/或權利要求19-25中任一項所述的引導rna。
27.一種核酸構建體，其包含根據權利要求26所述的核酸。
28.根據權利要求27所述的核酸，其中所述核酸構建體包含啟動子，其中所述啟動子包括cmv、ef1a、sv40、pgk、ubc、人β肌動蛋白、cag、tre、uas、ac5、gfap、多角體蛋白啟動子、tbg、alb、apoehcr-haat、camkiia、gal1、tef1、gds、adh1、camv35s、ubi、h1、u6、t7、t7lac、sp6、arabad、trp、lac、ptac、或pl。
29.根據權利要求27所述的核酸，其中所述核酸構建體通過5’端封端和/或3’端多聚腺苷酸化進行修飾，并且所述核酸構建體保留了核酸酶和/或引導rna的活性。
30.根據權利要求27所述的核酸，其中所述核酸構建體通過硫代磷酸酯鍵修飾、2’-moe(2-o-(2-甲氧基乙基))、pna(肽核酸)、gna(甘油核酸)、lna(鎖核酸)、galnac(n-乙酰半乳糖胺)、lnp(脂質納米顆粒)、pnp(肽納米顆粒)進行修飾。
31.一種組合物，其中所述組合物包含：
32.根據權利要求31所述的組合物，其中所述組合物選自下述組(1)-(198)中的至少一組，下述組(1)-(198)中的任一組包含：核酸酶相關序列和引導rna相關序列，
33.根據權利要求32所述的組合物，其中所述引導rna相關序列還包含靶向序列，所述靶向序列能夠識別與轉座子相關基序相鄰的靶基因。
34.根據權利要求33所述的組合物，其中所述靶向序列的長度為10-50、10-40、10-30、或15-25個核苷酸中的至少一種。
35.根據權利要求33所述的組合物，其中所述轉座子相關基序包含下式所示的核苷酸序列：
36.一種重組載體，其中所述重組載體包含編碼根據權利要求1-18中任一項所述的核酸酶的核酸、根據權利要求19-25中任一項所述的引導rna、根據權利要求26所述的核酸、根據權利要求27-30中任一項所述的核酸構建體、或根據權利要求31-35中任一項所述的組合物。
37.根據權利要求36所述的重組載體，其中所述重組載體包括重組克隆載體、重組真核表達質粒、或重組病毒載體。
38.根據權利要求37所述的重組載體，其中所述重組真核表達質粒包括pcdna3.1、pcmv、puc18、puc19、puc57、pbad、pet、pentr、pgenlenti、或paav。
39.根據權利要求37所述的重組載體，其中所述重組病毒載體包括重組腺病毒載體、重組腺相關病毒載體、重組逆轉錄病毒載體、重組單純皰疹病毒載體、或重組痘苗病毒載體。
40.一種重組宿主細胞，其中所述重組宿主細胞包含根據權利要求1-18中任一項所述的核酸酶、根據權利要求19-25中任一項所述的引導rna、根據權利要求26所述的核酸、根據權利要求27-30中任一項所述的核酸構建體、根據權利要求31-35中任一項所述的組合物、或根據權利要求36-39中任一項所述的重組載體。
41.根據權利要求40所述的重組宿主細胞，其中所述重組宿主細胞包括動物細胞、植物細胞、藻類細胞、真菌細胞、酵母...
【專利技術屬性】
技術研發人員：余大奇，魏婷，李彥莎，趙晨，石成蹊，
申請(專利權)人：北京星辰集因科技有限責任公司，
類型：發明
國別省市：
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