【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及一種檢測植物蛋白質(zhì)亞細胞定位表達載體及其應用，屬于分子生物學、生物技術(shù)、基因工程。
技術(shù)介紹
1、蛋白質(zhì)在植物細胞內(nèi)的定位是了解蛋白質(zhì)功能、基因調(diào)控和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的關(guān)鍵。近年來，隨著各種蛋白質(zhì)亞細胞定位方法的快速發(fā)展及技術(shù)需求的不斷提升，對于植物系統(tǒng)中應用靶向機制明確、特異性強、效果優(yōu)良的細胞器特異性標記物的研究引起了越來越多的重視。其中，細胞核定位常利用能夠與dna強結(jié)合的熒光染料dapi指示細胞核的位置，但dapi是一種可以穿透生物膜的高毒致癌物質(zhì)，操作過程具有危險性，且可能出現(xiàn)dapi不與核內(nèi)dna結(jié)合或結(jié)合效果差的現(xiàn)象，或者由于dapi與細胞核外的dna結(jié)合而出現(xiàn)假陽性的現(xiàn)象，為細胞核定位帶來不穩(wěn)定性。鑒于熒光蛋白基因在活細胞中的表達產(chǎn)物具有生物活性穩(wěn)定、信號特異性強、有效活性維持時間長、方便檢測和與融合目的基因相互影響小等特點，基因工程中常用作生物篩選標記，來研究目的基因的表達及其蛋白產(chǎn)物在細胞內(nèi)的分布和定位情況。目前，應用最為廣泛的熒光融合蛋白定位法是通過檢測融合蛋白報告基因的表達來判斷目標蛋白的亞細胞定位情況。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)所要解決的技術(shù)問題是，克服現(xiàn)有技術(shù)的不足而提供一種檢測植物蛋白質(zhì)亞細胞定位表達載體及其應用。
2、本專利技術(shù)提供一種檢測植物蛋白質(zhì)亞細胞定位表達載體，包括特異性定位于細胞核中的紅色熒光蛋白nls-dsred2表達盒和根據(jù)目標蛋白特性定位的綠色熒光蛋白egfp的融合表達盒dna分子，所述的雙表達盒d
3、(1)由super?promoter啟動子序列、cor47-5′utr序列、mcs位點、細胞核定位信號nls序列、紅色熒光蛋白dsred2編碼區(qū)序列和終止子hsp-t878序列依次順序連接組成的表達盒；
4、(2)由2×35s啟動子序列、cor47-5′utr序列、mcs位點、綠色熒光蛋白egfp編碼區(qū)序列和終止子hsp-t878序列依次順序連接組成的表達盒。
5、本專利技術(shù)利用細胞核特異性定位的nls、啟動活性更強的superpromoter和2×35s啟動子、翻譯起始增強子cor47-5′utr和可顯著增加基因表達量的hsp-t878終止子對熒光融合蛋白報告基因表達載體進行改進。通過表達增強的nls-dsred2和egfp熒光蛋白，創(chuàng)制的亞細胞定位表達載體在不同激發(fā)光下能夠分別發(fā)出清晰且穩(wěn)定的紅色和綠色信號，且不存在信號交叉干擾，紅色熒光信號能夠準確、特異定位在細胞核中，而綠色熒光信號可根據(jù)融合的目的蛋白的特性鑒定其亞細胞定位情況。此外，雙熒光蛋白報告基因通過串聯(lián)共表達可多功能性地實現(xiàn)一個載體一個菌雙熒光指示的便捷轉(zhuǎn)化，而通常在植物蛋白質(zhì)亞細胞定位的研究中需要單獨轉(zhuǎn)化核定位對照載體的農(nóng)桿菌，例如公開號為cn107794292a的中國專利就公開了需使用核定位農(nóng)桿菌菌液的亞細胞定位試劑盒。因此，改進的檢測植物蛋白質(zhì)亞細胞定位表達載體，無需接觸高毒致癌的dna熒光染料dapi且避免另外使用核定位對照載體，可節(jié)約使用成本并提升操作安全性和便捷性，非常適合應用于植物亞細胞定位研究。
6、本專利技術(shù)提供一種自帶核定位標記的用于觀察植物蛋白質(zhì)亞細胞定位表達情況的載體質(zhì)粒pcambia1300-nls-dsred2-egfp。研究發(fā)現(xiàn)，細胞核定位信號nls能夠穩(wěn)定且特異地將蛋白質(zhì)定位到細胞核中。因此，利用更強的super?promoter和2×35s啟動子、翻譯起始增強子cor47-5′utr和可顯著增加基因表達量的hsp-t878終止子以增強熒光蛋白信號，并通過細胞核定位信號nls將熒光蛋白dsred2特異性定位于細胞核，同時串聯(lián)共表達熒光蛋白egfp的組合能夠?qū)崿F(xiàn)自帶核定位標記的植物亞細胞定位表達載體的創(chuàng)新性開發(fā)和應用。通過將目的dna片段克隆到增強的egfp表達盒的mcs位點后，即可在激光共聚焦/熒光顯微鏡下利用特異性定位在細胞核中的紅色熒光信號作為核定位marker，根據(jù)綠色熒光信號檢測目標蛋白質(zhì)的亞細胞定位情況，無需接觸高毒致癌的dna熒光染料dapi，避免了使用核定位對照載體。
7、作為本專利技術(shù)進一步優(yōu)化的技術(shù)方案如下：
8、上述檢測植物蛋白質(zhì)亞細胞定位表達載體，所述紅色熒光蛋白dsred2特異性定位于細胞核中，所述綠色熒光蛋白egfp根據(jù)目標蛋白特性定位，所述紅色熒光蛋白dsred2和綠色熒光蛋白egfp通過激光共聚焦/熒光顯微鏡分別檢測到兩個相互獨立的熒光蛋白信號。
9、上述檢測植物蛋白質(zhì)亞細胞定位表達載體，所述基于紅色熒光蛋白dsred2的融合表達盒具有如seq?no.7中第1-2928nt所示的核苷酸序列，所述基于綠色熒光蛋白egfp的表達盒具有如seq?no.8中第1-2619nt所示的核苷酸序列。
10、含有上述檢測植物蛋白質(zhì)亞細胞定位表達載體質(zhì)粒pcambia1300-nls-dsred2-egfp及其構(gòu)建方法。
11、上述檢測植物蛋白質(zhì)亞細胞定位表達載體質(zhì)粒pcambia1300-nls-dsred2-egfp，連接有同向串聯(lián)共表達熒光蛋白報告基因編碼序列。
12、上述檢測植物蛋白亞細胞定位重組表達載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細胞或表達盒。
13、本專利技術(shù)通過在出發(fā)載體i：pcambia1300-superpromoter:cegfp的基礎上，于xba?i和ecor?i酶切位點之間置換入如下dna序列(xba?i酶切位點前含有superpromoter啟動子序列)：自5’至3’方向插入如下通過基因合成獲得的增強型表達框架cor47-5′utr-nls-dsred2-hsp-t878的dna分子，其由cor47-5′utr翻譯起始增強子序列、細胞核定位信號nls序列、紅色熒光蛋白dsred2編碼區(qū)序列和終止子hsp-t878序列依次順序連接組成，從而獲得中間載體pcambia1300-superpromoter-cor47-5′utr:nls-dsred2-hsp-t878(多克隆酶切位點mcs包括xma?i和bssh?ii)；進一步地，再經(jīng)pcr擴增獲得增強的nls-dsred2融合表達盒dna分子，通過同源重組酶將其與經(jīng)ecor?i單酶切的出發(fā)載體ii:pcambia1300-2×35s:egfp連接，在增強的egfp表達盒的基礎上于ecor?i酶切位點同向插入增強的nls-dsred2表達盒從而獲得終載體pcambia1300-nls-dsred2-egfp。所述特異性定位在細胞核中的紅色熒光蛋白nls-dsred2融合表達盒具有如seq?no.7中第1-2928nt所示的核苷酸序列，所述綠色熒光蛋白egfp表達盒具有如seq?no.8中第1-2619nt所示的核苷酸序列。
14、所述檢測植物蛋白質(zhì)亞細胞定位表達載體的dna分子也屬于本專利技術(shù)的保護范圍。含有所述dna分子、所述重組報告基因植物表達載體的轉(zhuǎn)基因重組菌或細胞也屬于本專利技術(shù)的保護范圍。
15、上述檢本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
1.一種檢測植物蛋白質(zhì)亞細胞定位表達載體，其特征在于，包括特異性定位于細胞核中的紅色熒光蛋白NLS?(Nuclear?localization?signal)-DsRed2表達盒和根據(jù)目標蛋白特性定位的綠色熒光蛋白eGFP的融合表達盒DNA分子，所述的雙表達盒DNA分子由（1）和（2）組成：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種檢測植物蛋白質(zhì)亞細胞定位表達載體，其特征在于：所述紅色熒光蛋白DsRed2定位于細胞核中，所述綠色熒光蛋白eGFP根據(jù)目標蛋白特性定位，所述紅色熒光蛋白DsRed2和綠色熒光蛋白eGFP通過激光共聚焦/熒光顯微鏡分別檢測到兩個相互獨立的熒光蛋白信號。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種檢測植物蛋白質(zhì)亞細胞定位表達載體，其特征在于：所述基于紅色熒光蛋白DsRed2的融合表達盒具有如SEQ?NO.?7中第1-2928?nt所示的核苷酸序列，所述基于綠色熒光蛋白eGFP的表達盒具有如SEQ?NO.?8中第1-2619?nt所示的核苷酸序列。
4.含有權(quán)利要求1或2或3所述檢測植物蛋白質(zhì)亞細胞定位表達載體質(zhì)粒pCAMBIA1300-NLS-DsR
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述檢測植物蛋白質(zhì)亞細胞定位表達載體質(zhì)粒pCAMBIA1300-NLS-DsRed2-eGFP，其特征在于：所述植物亞細胞定位表達載體質(zhì)粒連接有同向串聯(lián)共表達熒光蛋白報告基因編碼序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述檢測植物蛋白亞細胞定位重組表達載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細胞或表達盒。
7.如權(quán)利要求6所述檢測植物蛋白質(zhì)亞細胞定位表達載體的DNA分子，以及含有所述DNA分子、重組報告基因植物表達載體的轉(zhuǎn)基因重組菌或細胞。
8.如權(quán)利要求5所述檢測植物蛋白質(zhì)亞細胞定位表達載體的應用，其特征在于：所述表達載體用于檢測植物蛋白質(zhì)的亞細胞定位情況。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述檢測植物蛋白質(zhì)亞細胞定位表達載體的應用，其特征在于：所述的應用為通過激光共聚焦/熒光顯微鏡觀察含有植物蛋白質(zhì)亞細胞定位表達載體質(zhì)粒pCAMBIA1300-NLS-DsRed2-eGFP的農(nóng)桿菌瞬時轉(zhuǎn)化煙草葉肉細胞后的熒光信號，根據(jù)紅色熒光信號判斷細胞核定位及根據(jù)目標蛋白特性定位的綠色熒光信號的位置判斷植物目標蛋白質(zhì)的亞細胞定位情況。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述檢測植物蛋白質(zhì)亞細胞定位表達載體的應用，其特征在于，通過激光共聚焦/熒光顯微鏡觀察含有植物蛋白質(zhì)亞細胞定位表達載體質(zhì)粒pCAMBIA1300-NLS-DsRed2-eGFP的農(nóng)桿菌瞬時轉(zhuǎn)化煙草葉肉細胞后的熒光信號，根據(jù)定位于細胞核中的紅色熒光信號作為核定位Marker，并根據(jù)目標蛋白特性定位的綠色熒光信號的位置判斷植物蛋白質(zhì)的亞細胞定位情況，具體包括：（1）對于增強的eGFP表達盒的MCS位點不含有目的基因的空載體質(zhì)粒，當使用激光共聚焦/熒光顯微鏡觀察時，若煙草葉肉細胞中分布有特異性定位于細胞核中的紅色熒光信號和定位于細胞質(zhì)和細胞核中的綠色熒光信號，則兩個熒光蛋白正常表達；
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種檢測植物蛋白質(zhì)亞細胞定位表達載體，其特征在于，包括特異性定位于細胞核中的紅色熒光蛋白nls?(nuclear?localization?signal)-dsred2表達盒和根據(jù)目標蛋白特性定位的綠色熒光蛋白egfp的融合表達盒dna分子，所述的雙表達盒dna分子由（1）和（2）組成：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種檢測植物蛋白質(zhì)亞細胞定位表達載體，其特征在于：所述紅色熒光蛋白dsred2定位于細胞核中，所述綠色熒光蛋白egfp根據(jù)目標蛋白特性定位，所述紅色熒光蛋白dsred2和綠色熒光蛋白egfp通過激光共聚焦/熒光顯微鏡分別檢測到兩個相互獨立的熒光蛋白信號。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種檢測植物蛋白質(zhì)亞細胞定位表達載體，其特征在于：所述基于紅色熒光蛋白dsred2的融合表達盒具有如seq?no.?7中第1-2928?nt所示的核苷酸序列，所述基于綠色熒光蛋白egfp的表達盒具有如seq?no.?8中第1-2619?nt所示的核苷酸序列。
4.含有權(quán)利要求1或2或3所述檢測植物蛋白質(zhì)亞細胞定位表達載體質(zhì)粒pcambia1300-nls-dsred2-egfp及其構(gòu)建方法。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述檢測植物蛋白質(zhì)亞細胞定位表達載體質(zhì)粒pcambia1300-nls-dsred2-egfp，其特征在于：所述植物亞細胞定位表達載體質(zhì)粒連接有同向串聯(lián)共表達熒光蛋白報告基因編碼序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述檢測植物蛋白亞細胞定位重組表達...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：朱明庫，王藝霏，孟小慶，劉思媛，于婧，洪海婷，呂雨蒙，劉維威，王錦堯，董婷婷，
申請(專利權(quán))人：江蘇師范大學，
類型：發(fā)明
國別省市：
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