【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于基因工程，具體涉及一種高自聚集能力的基因工程菌及其構建方法和應用。
技術介紹
1、植物乳桿菌是一種占據廣泛生態位的革蘭氏陽性菌，可以代謝碳水化合物進而產生乳酸。它不僅能夠改變食物的風味質地，延緩食品的腐敗變質，還同時具備良好的益生特性和治療效果，因而被廣泛運用于食品加工、醫療保健相關的各個領域。為了更好地生存繁殖和發揮功能，植物乳桿菌需要具備優秀的聚集能力來進行脅迫抵御和腸道定殖。植物乳桿菌能夠通過形成多細胞聚集體來促進營養交換，提供壓力保護，進而為自身創造一個利于存活、定殖的新生態位。然而，天然植物乳桿菌的聚集能力存在上限。因此，需要通過引入基因編輯技術來進一步挖掘它們用作腸道黏附定殖活性載體的潛力，開拓它們在食品加工和醫藥工程中的應用前景。
2、gdpp是第二信使分子c-di-amp降解酶的編碼基因，其缺失會引發細菌胞內的c-di-amp穩態失衡，進而改變細菌的聚集特性。植物乳桿菌作為革蘭氏陽性菌，遺傳操作困難，目前通過基因工程技術敲除gdpp基因提高植物乳桿菌聚集能力的方法尚未見報道。
技術實現思路
1、針對現有技術存在的上述問題，本申請提供一種高自聚集能力的基因工程菌及其構建方法和應用。
2、為解決上述問題，本專利技術提供如下技術方案：
3、第一方面，本申請提供一種高自聚集能力的基因工程菌，由植物乳桿菌lactobacillus?plantarum?wcfs1的gdpp基因失活后改造制得，gdpp基因失活后改造的核苷酸序列如
4、在本申請的一種實施方式中，gdpp基因的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。
5、第二方面，本申請提供一種高自聚集能力的基因工程菌的構建方法，包括以下步驟：
6、s1、提取植物乳桿菌lactobacillusplantarum?wcfs1的基因組dna并以提取的基因組dna為模板，利用引物gdpp-uf/gdpp-ur和gdpp-df/gdpp-dr分別擴增gdpp的上下游同源臂片段；
7、s2、以pnz5319載體為模板，利用引物if-gdpp-f1和if-gdpp-r1擴增包含lox位點的片段；
8、s3、以gdpp的上下游同源臂片段和包含lox位點的片段共同為模板，利用引物if-gdpp-f2和if-gdpp-r2進行重疊pcr擴增，獲得融合片段；
9、s4、以pnz5319載體為模板，利用引物pnz5319-f和pnz5319-r反向pcr擴增，獲得pnz5319線性載體片段；
10、s5、通過無縫克隆技術，將融合片段與pnz5319線性載體片段進行連接，構建敲除載體pnz5319-udgdpp；
11、s6、將敲除載體pnz5319-udgdpp電轉化至wcfs1感受態細胞內，經篩選獲得目標重組子；
12、s7、提取目標重組子的基因組dna并以其基因組dna為模板，利用引物v-gdpp-uf/v-gdpp-ur和v-gdpp-df/v-gdpp-dr分別驗證gdpp基因的敲除。
13、在本申請的一種實施方式中，引物gdpp-uf/gdpp-ur和gdpp-df/gdpp-dr的序列為：
14、gdpp-uf：5′-cgtcaattcacgaatcaaaatgggg-3′；
15、gdpp-ur：5′-cgaaaagatctttttcatattaaaaatccctca-3′；
16、gdpp-df：5′-gaatctaattaggagtgagtctaaatg-3′；
17、gdpp-dr：5′-cacatctgaaatcgacttaaacc-3′。
18、在本申請的一種實施方式中，引物if-gdpp-f1和if-gdpp-r1的序列為：
19、if-gdpp-f1：5′-gaaaaagatcttttcgtaccgttcgtataatg-3′；
20、if-gdpp-r1：5′-ctcctaattagattctaccgttcgtatagcatac-3′。
21、在本申請的一種實施方式中，引物if-gdpp-f2和if-gdpp-r2的序列為：
22、if-gdpp-f2：5′-gataacgcgctcgagcgtcaattcacgaatc-3′；
23、if-gdpp-r2：5′-gtcagctttagagatctcacatctgaaatcg-3′。
24、在本申請的一種實施方式中，引物pnz5319-f和pnz5319-r的序列為：
25、pnz5319-f：5′-agatctctaaagctgacggggtaaac-3′；
26、pnz5319-r：5′-ctcgagcgcgttatcggtcctttaat-3′。
27、在本申請的一種實施方式中，上述擴增體系，以總體積50μl計，包括25μl?2×taqpcr?mix；1μl模板；2μl上游引物；2μl下游引物和20μl水。
28、在本申請的一種實施方式中，擴增反應程序為：95℃5min；95℃35s、55℃35s、72℃1min，30個循環；72℃10min。
29、在本申請的一種實施方式中，電轉化的電壓為1.8-2.2kv，電轉化的時間為4-5ms。
30、在本申請的一種實施方式中，目標重組子具有氯霉素抗性但不具有紅霉素抗性，氯霉素在抗性平板中的濃度為10μg/ml，紅霉素在抗性平板中的濃度為30μg/ml。
31、在本申請的一種實施方式中，篩選目標重組子的方法為：將菌液復蘇，在氯霉素平板上劃線，37℃厭氧培養。次日挑取單菌落分別點在氯霉素和紅霉素的抗性平板上，37℃厭氧培養1-2天，篩選出具有氯霉素抗性但不具有紅霉素抗性的目標重組子。
32、在本申請的一種實施方式中，引物v-gdpp-uf/v-gdpp-ur和v-gdpp-df/v-gdpp-dr的序列為：
33、v-gdpp-uf：5′-cgttaacttaacagcaactgacgatg-3′；
34、v-gdpp-ur：5′-ctgtggttatactaaaagtcgtttgttgg-3′；
35、v-gdpp-df：5′-gcaggattgtttatgaactctattcagg-3′；
36、v-gdpp-dr：5′-caaactgaaaatggccactgtcg-3′。
37、第三方面，本申請提供一種高自聚集能力的基因工程菌在制備促植物乳桿菌黏附定殖產品中的應用。
38、與現有技術相比，本申請通過擴增gdpp基因上下游同源臂序列和lox位點序列，重疊pcr獲得融合片段，反向pcr獲得線性載體片段，無縫克隆構建gdpp敲除載體，電轉化載體質粒，篩選gdpp缺失突變株本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種高自聚集能力的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌由植物乳桿菌Lactobacillusplantarum?WCFS1的gdpP基因失活后改造制得，gdpP基因失活后改造的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。
2.權利要求1所述的高自聚集能力的基因工程菌的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：
3.根據權利要求2所述的高自聚集能力的基因工程菌的構建方法，其特征在于，所述引物gdpP-UF/gdpP-UR和gdpP-DF/gdpP-DR的序列為：
4.根據權利要求2所述的高自聚集能力的基因工程菌的構建方法，其特征在于，所述引物IF-gdpP-F1和IF-gdpP-R1的序列為：
5.根據權利要求2所述的高自聚集能力的基因工程菌的構建方法，其特征在于，所述引物IF-gdpP-F2和IF-gdpP-R2的序列為：
6.根據權利要求2所述的高自聚集能力的基因工程菌的構建方法，其特征在于，所述引物pNZ5319-F和pNZ5319-R的序列為：
7.根據權利要求2所述的高自聚集能力的基因工程菌的構建方法，其
8.根據權利要求2所述的高自聚集能力的基因工程菌的構建方法，其特征在于，所述目標重組子具有氯霉素抗性但不具有紅霉素抗性，所述氯霉素在抗性平板中的濃度為10μg/mL，所述紅霉素在抗性平板中的濃度為30μg/mL。
9.根據權利要求2所述的高自聚集能力的基因工程菌的構建方法，其特征在于，所述引物V-gdpP-UF/V-gdpP-UR和V-gdpP-DF/V-gdpP-DR的序列為：
10.權利要求1所述的高自聚集能力的基因工程菌在制備促植物乳桿菌黏附定殖產品中的應用。
...【技術特征摘要】
1.一種高自聚集能力的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌由植物乳桿菌lactobacillusplantarum?wcfs1的gdpp基因失活后改造制得，gdpp基因失活后改造的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。
2.權利要求1所述的高自聚集能力的基因工程菌的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：
3.根據權利要求2所述的高自聚集能力的基因工程菌的構建方法，其特征在于，所述引物gdpp-uf/gdpp-ur和gdpp-df/gdpp-dr的序列為：
4.根據權利要求2所述的高自聚集能力的基因工程菌的構建方法，其特征在于，所述引物if-gdpp-f1和if-gdpp-r1的序列為：
5.根據權利要求2所述的高自聚集能力的基因工程菌的構建方法，其特征在于，所述引物if-gdpp-f2和if-gdpp-r2的序列為：
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【專利技術屬性】
技術研發人員：於釗慶，李大婧，戴竹青，何偉偉，龐心怡，張執，
申請(專利權)人：江蘇省農業科學院，
類型：發明
國別省市：
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