【技術實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術屬于生物基因工程領域，具體涉及一種ace2基因缺失斑馬魚突變體的制備方法及其應用。
技術介紹
1、隨著分子生物學和基因工程技術的快速發(fā)展，基因編輯技術，尤其是crispr-cas9系統(tǒng)，已成為當前生物科學研究中的一個重要工具。這一技術因其高效、精準和易于操作的特點，在多個生物學領域中得到了廣泛應用，包括疾病模型的構建、基因功能的研究、以及遺傳疾病的治療等。斑馬魚(danio?rerio)作為一種經(jīng)典的模式生物，因其獨特的生物學特性——如透明的胚胎、快速的生長周期和與人類高度保守的基因序列——而被廣泛用于生物醫(yī)學研究。特別是在生長發(fā)育、遺傳病和藥物篩選等領域，斑馬魚模型為我們提供了深入理解基因功能和疾病機理的窗口。
2、ace2(血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2)作為一個關鍵的生理調(diào)節(jié)因子，近年來在人類心血管疾病、代謝疾病的研究中顯示出其重要作用。盡管ace2在哺乳動物生理過程中的功能已經(jīng)得到了一定程度的研究和理解，但在非哺乳動物模型，特別是在斑馬魚這樣的模式生物中，關于ace2基因在生長發(fā)育中的作用和調(diào)控機制仍然不夠清晰。
3、此外，隨著全球水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，如何通過遺傳改良和生物技術手段提高養(yǎng)殖魚類的生長速度、增強其抗病力和適應性成為研究的熱點。然而，缺乏有效的基因功能研究模型限制了在這一領域的科學研究和應用進展。
4、因此，開發(fā)一種基于基因編輯技術的斑馬魚ace2基因突變模型，用于研究ace2基因在魚類生長發(fā)育中的作用，不僅可以為理解斑馬魚甚至是廣泛魚類的生長機制提供新的科學依據(jù)，同時也為
技術實現(xiàn)思路
1、本專利技術的目的是針對以上要解決的技術問題，提供一種操作簡單、效果明顯ace2基因缺失斑馬魚突變體的制備方法。
2、為了實現(xiàn)以上專利技術目的，本專利技術提供了一種ace2基因缺失斑馬魚突變體的制備方法，其包括以下步驟：將人工體外轉(zhuǎn)錄合成的sgrna片段和cas9蛋白混合后，通過顯微注射將混合液注射到1-2細胞期的斑馬魚受精卵中，受精卵孵化后培養(yǎng)，即得所述ace2基因缺失斑馬魚突變體。
3、優(yōu)選地，通過crispr/cas9技術，針對斑馬魚ace2基因組1號外顯子設計sgrna。
4、更優(yōu)選地，sgrna靶點序列位于斑馬魚ace2基因組1號外顯子上，sgrna靶點序列為5’-ggcctgctgtcagactgtgg-3’所示。
5、更優(yōu)選地，針對sgrna的pcr引物對如下：
6、上游正向引物序列：5’-caacagcgtcagaatcggtg-3’；
7、下游反向引物序列：5’-gttgaggaattcccttgctctg-3’。
8、優(yōu)選地，用于表達sgrna的載體為pdr274-sgrna載體。
9、優(yōu)選地，所述方法的具體步驟如下：
10、s1、將grna靶點序列設計在斑馬魚ace2基因組1號外顯子上，sgrna靶點序列為5’-ggcctgctgtcagactgtgg-3’；
11、s2、合成引物：
12、sgrna合成上游正向引物：5’-taggcctgctgtcagactgtgg-3’；
13、sgrna合成下游反向引物：5’-aaacccacagtctgacagcagg-3’；
14、s3、合成目的sgrna的雙鏈：吸取s2的合成引物各10μl、ddh2o?80μl至離心管中，輕輕渦旋混勻，短暫離心使全部液體都處于離心管底部，然后于95℃水浴加熱10分鐘，自然冷卻，上述s2引物退火形成的雙鏈均帶有“tagg-”和“aaac-”黏性末端。
15、s4、制備pdr274-sgrna載體：使用bsaⅰ酶對pdr274質(zhì)粒進行限制性剪切，使用t4連接酶將上述退火得到的雙鏈和bsaⅰ酶剪切后的pdr274質(zhì)粒連接起來，并以連接產(chǎn)物為模板進行pcr擴增，所選引物為上游正向引物5’-taggcctgctgtcagactgtgg-3’、下游反向引物5’-gtaaaacgacggccagt-3’；
16、s5、制備sgrna體外轉(zhuǎn)錄模板：以pdr274-sgrna載體為模板，使用引物：上游正向引物5’-ctcaggaaacagctatgaca-3’；下游反向引物5’
17、-tttaaaagcaccgactcggtgccac-3’，進行pcr并純化回收pcr產(chǎn)物，作為sgrna體外轉(zhuǎn)錄模板；
18、s6、grna的合成：將步驟s5的sgrna體外轉(zhuǎn)錄模板用t7轉(zhuǎn)錄酶進行體外轉(zhuǎn)錄、純化回收獲得sgrna；
19、s7、顯微注射：將步驟s6回收獲得grna和商業(yè)化的cas9蛋白混合后顯微注射入斑馬魚1-2細胞期胚胎，注射胚胎數(shù)為600枚；
20、s8、靶點有效性檢測：收集步驟s7注射后24小時的斑馬魚胚胎20枚，提取基因組dna，pcr擴增包含靶點的目標序列并測序，用于pcr的引物為上游正向引物5’
21、-caacagcgtcagaatcggtg-3’；下游反向引物5’-gttgaggaattcccttgctctg-3’；測序結果在靶點附近顯示亂峰的注射批次胚胎進入飼養(yǎng)系統(tǒng)，飼養(yǎng)待性成熟，所得個體為基因敲除陽性嵌合體f0；陽性f0個體與野生型測交，通過對其下一代斑馬魚的突變基因型進行檢測，獲得具有有效突變的ace2突變斑馬魚f1(+/-)；選取有效突變類型相同的雌-雄斑馬魚突變體進行自交，得到斑馬魚純合子突變體f2(-/-)。
22、另一方面，本專利技術還提供了根據(jù)所述方法獲得的ace2基因缺失斑馬魚突變體用于研究ace2調(diào)控腸道功能介導魚類生長機制的應用。
23、另一方面，本專利技術還提供了根據(jù)所述方法獲得的ace2基因缺失斑馬魚突變體用于研究宿主遺傳介導的腸道功能和腸道菌群調(diào)控機制的應用。
24、另一方面，本專利技術還提供了根據(jù)所述方法獲得的ace2基因缺失斑馬魚突變體用于篩選治療腸道紊亂的藥物和治療方法的應用。
25、另一方面，本專利技術還提供了根據(jù)所述方法獲得的ace2基因缺失斑馬魚突變體用于篩選有益于腸道穩(wěn)態(tài)和生長的腸道菌群的應用。
26、本專利技術采用ace2突變斑馬魚作為實驗動物，構建的生長抑制模型效果顯著，能夠有效的反映出ace2調(diào)控腸道功能從而影響生長發(fā)育的發(fā)生機制。此外，本專利技術的方法成本低，周期短、重復型好、可靠性強，可以有效的降低實驗成本，深入研究ace2調(diào)控的腸道功能和菌群對生長發(fā)育的調(diào)控機制，有利于篩選對生長有益的腸道菌群，并進行驗證，有助于認識ace2調(diào)控魚類生長的發(fā)展規(guī)律，為推動魚類快速生長、飼料高效利用品種選育提供理論依據(jù)。
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1.一種Ace2基因缺失斑馬魚突變體的制備方法，其包括以下步驟：將人工體外轉(zhuǎn)錄合成的sgRNA片段和Cas9蛋白混合后，通過顯微注射將混合液注射到1-2細胞期的斑馬魚受精卵中，受精卵孵化后培養(yǎng)，即得所述Ace2基因缺失斑馬魚突變體。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，通過CRISPR/Cas9技術，針對斑馬魚ace2基因組1號外顯子設計sgRNA。
3.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于，所述sgRNA靶點序列位于斑馬魚ace2基因組1號外顯子上，sgRNA靶點序列為5’-GGCCTGCTGTCAGACTGTGG-3’。
4.根據(jù)權利要求3所述的方法，其特征在于，針對sgRNA的PCR引物對如下：
5.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，用于表達sgRNA的載體為pDR274-sgRNA載體。
6.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法的具體步驟如下：
7.根據(jù)權利要求1至6中任一項所述的方法獲得的Ace2基因缺失斑馬魚突變體用于研究ace2調(diào)控腸道功能介導魚類生長機制的應用。
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