【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物，尤其涉及一種對蚊蟲進行基因編輯調控蚊媒病毒感染的方法。
技術介紹
1、近年來，登革熱、寨卡、瘧疾等蚊媒傳染病的全球發病率顯著上升，對公共衛生構成重大挑戰。目前，絕大多數蚊媒傳染病針對內潛伏期(人體感染期)尚無有效治療方案和預防性疫苗，主要防控策略是針對外潛伏期(蚊蟲感染期)采用環境防制和化學防制為主的綜合防制策略來切斷蚊媒傳播途徑。然而，隨著蚊蟲抗藥性的逐年增加以及環境保護等問題，傳統的防制策略受到前所未有的挑戰。隨著基因編輯技術的發展，針對外潛伏期的蚊蟲免疫生物阻斷研究已成為當今阻斷蚊媒病傳播的重要研究方向。
2、crispr/cas系統是古細菌的一種獲得性免疫系統，通過cas蛋白切割噬菌體dsdna，從而破壞噬菌體基因組，達到細菌免疫噬菌體的目的。crispr/cas9是cas系統ⅱ型家族的一種核酸內切酶，能夠對基因組ngg?pam結構向5’方向第3和第4個堿基之間進行定點剪切，造成dna雙鏈斷裂。再經細胞dna修復機制非同源末端連接和同源修復將斷開的dna鏈重新連接在一起，從而實現基因組dna序列的編輯。crispr/cas9技術的出現為開展蚊蟲生理、生化、發育、宿主與病原體關系等諸多方面分子生物基礎研究提供了靶標特異性的修飾工具，給蚊媒控制技術的發展帶來了新的契機。
3、近年來已有一些采用基因編輯技術以避免蚊蟲疾病傳播的報道。如美國陸軍合作生物技術研究所和加州大學圣巴巴拉分校的研究人員使用了crispr/cas9基因編輯工具，以雄蚊生育能力相關基因為目標，對埃及伊蚊進行了“絕育
技術實現思路
1、為解決上述技術問題，本專利技術針對蚊媒傳染病外潛伏期提供了一種基因編輯防控蚊媒病毒感染的方法，通過對蚊蟲基因組特定區域進行敲除，降低了蚊媒病毒感染的概率，為這類疾病的處理提供了新的方向。
2、本專利技術的第一個目的是提供敲除或部分敲除seq?id?no.2所示基因序列或其同源序列的物質在制備蚊媒傳染病防治產品中的應用。
3、進一步地，部分敲除包括敲除seq?id?no.2所示基因序列的第73-99位堿基或其同源序列。
4、進一步地，所述敲除或部分敲除seq?id?no.2所示基因序列或其同源序列的物質包括crispr/cas系統、sirna、shrna、慢病毒包裹的序列等。
5、進一步地，所述crispr/cas系統包括sgrna和cas9核酸酶。所述cas9核酸酶利用所述sgrna的識別和定位完成對目的基因片段的切割，導致蚊蟲或蚊蟲細胞內的目的基因片段斷裂，從而發生同源重組修復或非同源末端連接，進而造成堿基移碼突變實現基因敲除的目的。
6、進一步地，所述sgrna以seq?id?no.2所示序列或其中一部分序列為靶點進行設計。
7、進一步地，所述sgrna針對seq?id?no.3所示的靶點進行設計。
8、進一步地，所述sgrna的序列如seq?id?no.4所示。
9、進一步地，所述蚊媒傳染病防治包括但不限于對蚊蟲或蚊蟲細胞進行編輯降低病毒感染概率的步驟。
10、進一步地，所述蚊媒傳染病包括但不限于登革熱、寨卡、瘧疾、絲蟲病、乙型腦炎、包蟲病、蛔蟲病、黃熱病、基孔肯雅熱病等，即防控登革熱病毒(denv)、寨卡病毒(zikv)、瘧疾蟲、絲蟲、乙型腦炎病毒、棘球絳蟲、蛔蟲、黃熱病毒、基孔肯雅病毒(chikv)等的感染。
11、本專利技術首次利用crispr/cas9技術在埃及伊蚊中對mal1進行基因敲除，獲得mal1基因部分敲除的埃及伊蚊，后續功能驗證實驗表明：與野生型埃及伊蚊相比，該mal1基因部分敲除的埃及伊蚊感染病毒后的病毒載量有所下降，說明抑制mal1基因的物質可用于防治蚊蟲傳播的疾病。同時本專利技術制備的mal1基因部分敲除的埃及伊蚊可作為蚊蟲與病毒相互作用及蚊蟲代謝研究的體內研究模型，同時本專利技術對蚊蟲進行基因編輯的成功也使得對更多非模式生物進行基因編輯成為可能。
12、本專利技術的第二個目的是提供一種預防或治療蚊媒傳染病藥物(針對蚊蟲感染期)，含有敲除或部分敲除seq?id?no.2所示基因序列或其同源序列的物質。
13、進一步地，所述蚊媒傳染病藥物施用于蚊蟲或蚊蟲細胞。
14、進一步地，所述敲除或部分敲除seq?id?no.2所示基因序列或其同源序列的物質包括crispr/cas系統、sirna、shrna、慢病毒包裹的序列等。
15、進一步地，所述crispr/cas系統包括sgrna和cas9核酸酶。
16、進一步地，所述sgrna以seq?id?no.2所示序列或其中一部分序列為靶點進行設計。
17、進一步地，所述sgrna針對seq?id?no.3所示的靶點進行設計。
18、進一步地，所述sgrna的序列如seq?id?no.4所示。
19、進一步地，所述蚊媒傳染病藥物用于以下至少一種場景：
20、1)抑制蚊蟲或蚊蟲細胞病毒感染；
21、2)防治蚊蟲傳播的疾病；
22、3)制備病毒感染水平降低的轉基因蚊蟲。
23、本專利技術的第三個目的是提供一種降低蚊蟲或蚊蟲細胞病毒感染水平的方法，包括敲除或部分敲除(全長或一部分片段)蚊蟲或蚊蟲細胞中seq?id?no.2所示基因序列或其同源序列的步驟。
24、進一步地，包括敲除蚊蟲或蚊蟲細胞中seq?id?no.2中aatgaagatctttgttccacttctaag片段或其同源序列的步驟。
25、進一步地，所述敲除的方式包括但不限于，將包含seq?id?no.5的序列替換為包含seq?id?no.6的序列、靶向敲除aatgaagatctttgttccacttctaag片段等。
26、當然，本專利技術也提供了一種制備病毒感染水平降低的轉基因蚊蟲的方法，包括如下1)或2)：
27、1)抑制蚊蟲中mal1蛋白質活性或降低蚊蟲中mal1蛋白質含量；
28、2)將蚊蟲中對應于序列表中seq?id?no.5所示的dna分子替換為對應于序列表中seq?id?no.6所示的dna分子。
29、進一步地，所述方法還包括將所述sgrna和cas9核酸酶顯微注射入蚊卵的步驟。優選地，所述sgrna的終濃度為20-60ng/ul，所本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.敲除或部分敲除SEQ?ID?NO.2所示基因序列或其同源序列的物質在制備蚊媒傳染病防治產品中的應用。
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于：部分敲除包括敲除SEQ?ID?NO.2所示基因序列的第73-99位堿基或其同源序列。
3.根據權利要求1所述的應用，其特征在于：所述敲除或部分敲除SEQ?ID?NO.2所示基因序列或其同源序列的物質包括CRISPR/Cas系統、siRNA、shRNA或慢病毒包裹的序列。
4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于：所述CRISPR/Cas系統包括sgRNA和Cas9核酸酶；所述sgRNA選自以下至少一項：
5.一種蚊媒傳染病藥物，其特征在于：所述蚊媒傳染病藥物含有以下至少一項：
6.根據權利要求5所述的蚊媒傳染病藥物，其特征在于：所述蚊媒傳染病藥物施用于蚊蟲或蚊蟲細胞。
7.一種降低蚊蟲或蚊蟲細胞病毒感染水平的方法，其特征在于：包括敲除或部分敲除蚊蟲或蚊蟲細胞中SEQ?ID?NO.2所示基因序列或其同源序列的步驟。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在
9.一種病毒感染水平降低的蚊蟲模型或蚊蟲細胞模型的構建方法，其特征在于：包括敲除或部分敲除蚊蟲或蚊蟲細胞基因組上SEQ?ID?NO.2所示基因序列或其同源序列的步驟。
10.根據權利要求9所述的構建方法，其特征在于：蚊蟲模型的具體構建方法包括：
...【技術特征摘要】
1.敲除或部分敲除seq?id?no.2所示基因序列或其同源序列的物質在制備蚊媒傳染病防治產品中的應用。
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于：部分敲除包括敲除seq?id?no.2所示基因序列的第73-99位堿基或其同源序列。
3.根據權利要求1所述的應用，其特征在于：所述敲除或部分敲除seq?id?no.2所示基因序列或其同源序列的物質包括crispr/cas系統、sirna、shrna或慢病毒包裹的序列。
4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于：所述crispr/cas系統包括sgrna和cas9核酸酶；所述sgrna選自以下至少一項：
5.一種蚊媒傳染病藥物，其特征在于：所述蚊媒傳染病藥物含有以下至少一項：<...
【專利技術屬性】
技術研發人員：蘭策介，李滿金，程進，劉全超，鄒亞明，朱丁，周偉杰，
申請(專利權)人：無錫市疾病預防控制中心，
類型：發明
國別省市：
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