【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于5-氨基乙酰丙酸的發(fā)酵，具體涉及一種發(fā)酵制備5-氨基乙酰丙酸的方法。
技術(shù)介紹
1、5-氨基乙酰丙酸（5-ala）是四氫吡咯（四氫吡咯是構(gòu)成血紅素、細(xì)胞色素、維生素b12）的前綴化合物，是生物合體合成葉綠素、血紅素、維生素b12等必不可少的物質(zhì)；5-ala作為一種環(huán)境相容性及選擇性很高的物質(zhì)，在醫(yī)藥領(lǐng)域和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價值；醫(yī)學(xué)上5-ala作為一種新型光動力藥物，不僅用于局部或全身的皮膚癌的治療，還可用于膀胱癌、消化道癌、肺癌等的診斷；在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，其可以作為植物生長調(diào)節(jié)劑，提高光合效率，促進(jìn)光合作用，參與植物生長發(fā)育的調(diào)節(jié)過程；還可以作為綠色除草劑，殺蟲劑等。
2、目前，生產(chǎn)5-ala的方法主要包括化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法，關(guān)于化學(xué)合成法，研究者先后以馬尿酸、琥珀酸、四氫糠胺以及乙酰丙酸等為原料合成了5-ala，但是其存在試劑價格高不易獲取、毒性高、收率低、反應(yīng)條件苛刻等缺點(diǎn)。
3、關(guān)于微生物發(fā)酵法，cn118109527a公開了一種采用構(gòu)巢曲霉發(fā)酵產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸的工藝，包括以下步驟：構(gòu)建構(gòu)巢曲霉工程菌株，制備構(gòu)巢曲霉孢子液，發(fā)酵制備5-氨基乙酰丙酸，外源添加磷酸吡哆醛和鐵離子，調(diào)整轉(zhuǎn)速及ph，在此基礎(chǔ)上，外源添加乙酰丙酸，并采用5l發(fā)酵罐補(bǔ)料發(fā)酵。
4、該專利通過對菌株進(jìn)行外源添加，優(yōu)化發(fā)酵條件，提高5-氨基乙酰丙酸產(chǎn)量至4.134±0.256g/l，但是發(fā)酵時間較長，降低了產(chǎn)率。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、為了解決現(xiàn)有技術(shù)存
2、針對上述技術(shù)問題，本專利技術(shù)采取以下技術(shù)方案：
3、1.活化培養(yǎng)
4、將谷氨酸棒桿菌進(jìn)行置于活化培養(yǎng)基中進(jìn)行活化培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為23-25h，培養(yǎng)溫度為28-30℃，得到活化培養(yǎng)液；
5、所述谷氨酸棒桿菌由市場購買所得；
6、所述活化培養(yǎng)基的成分為，胰蛋白胨10.2—10.6g/l、硫酸鎂0.7-0.9g/l、瓊脂1.8-2.2g/l、酵母浸膏3.4-4.0g/l、氯化鈉0.8-1.2g/l，ph為6.5-6.7。
7、2.一級種子培養(yǎng)
8、將活化培養(yǎng)液按照0.25%的接種量接種于一級種子培養(yǎng)基上進(jìn)行一級種子培養(yǎng)，得到一級種子培養(yǎng)液；一級種子培養(yǎng)條件為，培養(yǎng)溫度為28-30℃，轉(zhuǎn)速為195-206rpm，培養(yǎng)時間為16-18h；
9、所述一級種子培養(yǎng)基的成分為，葡萄糖8.5-9.0g/l、胰蛋白胨7.2-7.6g/l、酵母粉12.1-12.5g/l、磷酸氫二鉀1.0-1.4g/l、磷酸二氫鉀0.8-1.2g/l、生長劑1.1-1.3g/l；
10、所述生長劑為硫胺素和蕓苔素內(nèi)酯，所述硫胺素和蕓苔素內(nèi)酯的質(zhì)量比為1.2-1.4:1.6-1.8。
11、3.二級種子培養(yǎng)
12、將一級種子培養(yǎng)液按照5%的接種量接種于二級種子培養(yǎng)基上進(jìn)行二級種子培養(yǎng)，得到二級種子培養(yǎng)基；二級種子培養(yǎng)條件為，培養(yǎng)溫度為30-33℃，轉(zhuǎn)速為215-225rpm，培養(yǎng)時間為19-22h；
13、所述二級種子培養(yǎng)基的成分為，葡萄糖6.7-7.2g/l、胰蛋白胨6.0-6.5g/l、硫酸鎂0.6-1.0g/l、feso4·7h2o?0.8-1.2g/l、硫酸銨0.7-1.1g/l、穩(wěn)定劑0.30-0.35g/l；
14、所述穩(wěn)定劑為鈷胺素、甘露醇的混合物，所述鈷胺素、甘露醇的質(zhì)量比為1:0.8-1.2。
15、4.發(fā)酵培養(yǎng)
16、將二級種子培養(yǎng)液按照10%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基上進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵過程中，控制攪拌轉(zhuǎn)速為263-274rpm，發(fā)酵溫度為35-37℃，壓力為0.05-0.07mpa，并用24-26wt%氨水溶液控制ph值為6.2-6.5，發(fā)酵第0-24h控制溶氧量為28-32%，發(fā)酵24h后至發(fā)酵終點(diǎn)，控制溶氧量為9-11%，在發(fā)酵至第2.5h時，加入終濃度為0.08-0.12mmol/l的iptg誘導(dǎo)劑和終濃度為3.8-4.2g/l的甘氨酸溶液，在發(fā)酵至第14h時，流加發(fā)酵促進(jìn)劑，流加速度為0.04-0.06g/h/l，流加時間為4.0-4.4h，控制發(fā)酵周期為34.8-35.1h，制得發(fā)酵培養(yǎng)液；
17、所述發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為，葡萄糖16.4-17.0g/l、胰蛋白胨9.6-10.0g/l、硫酸錳0.013-0.017g/l、氯化銨3.0-3.4g/l、發(fā)酵營養(yǎng)液1.4-1.6g/l；
18、所述發(fā)酵營養(yǎng)液的制備方法為，向去離子水中加入異亮氨酸、天冬氨酸，升高溫度至35-37℃，在242-255rpm下攪拌27-33min，攪拌結(jié)束后，加入槐糖脂和甘油，進(jìn)行超聲處理，超聲時間為14-17min，超聲頻率為23-28khz，超聲功率為225-234w，超聲結(jié)束后，制得發(fā)酵營養(yǎng)液；
19、所述去離子水、異亮氨酸、天冬氨酸、槐糖脂和甘油的質(zhì)量比為13.7-14.1:2.5-2.7:2.6-3.0:0.8-1.2:1.2-1.6；
20、所述發(fā)酵促進(jìn)劑是由油酸、谷胱甘肽組成，所述油酸、谷胱甘肽的質(zhì)量比為1.6-1.8:1.0-1.2。
21、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本專利技術(shù)取得了以下有益效果：
22、1.本專利技術(shù)對谷氨酸棒桿菌進(jìn)行了兩級種子培養(yǎng)，在一級種子培養(yǎng)過程中加入了生長劑，其可以促進(jìn)菌體的細(xì)胞分裂和生長，刺激生長和繁殖，縮短了菌種在種子培養(yǎng)基中的延遲，有利于提高在發(fā)酵中后期菌種的活性，并且促進(jìn)糖類的分解代謝，為微生物的生長提供能量，在提供營養(yǎng)的同時加快菌種的生長代謝速度，進(jìn)而增加5-ala?產(chǎn)量，在二級種子培養(yǎng)中，加入穩(wěn)定劑，其可以優(yōu)化微生物的代謝途徑，提供碳源和能量，促進(jìn)菌體的生長和代謝，為后續(xù)的發(fā)酵過程提供充足的接種量和高密度的微生物種群，改善發(fā)酵的一致性和發(fā)酵效率；在發(fā)酵步驟中，發(fā)酵培養(yǎng)基中特定的發(fā)酵營養(yǎng)液，其中的氨基酸和甘油成分，主要是提供能源被微生物利用，促進(jìn)微生物的代謝，提高生產(chǎn)效率，而槐糖脂可以降低表面張力，增加細(xì)胞通透性，改善菌體與培養(yǎng)基之間的相互作用，從而提高菌體對于營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用率，減少能量的消耗，提高產(chǎn)酸性能，提高5-氨基乙酰丙酸的產(chǎn)量；其結(jié)合發(fā)酵促進(jìn)劑，調(diào)節(jié)微生物細(xì)胞膜的流動性，保護(hù)菌種在發(fā)酵過程中的穩(wěn)定性，在各種助劑的共同作用下，促進(jìn)了發(fā)酵過程的進(jìn)行和5-氨基乙酰丙酸的積累，降低副產(chǎn)物的含量，實(shí)現(xiàn)了5-ala的產(chǎn)量進(jìn)一步提高；
23、2.采用本專利技術(shù)的方法得到的發(fā)酵培養(yǎng)液，5-ala的含量為21.2-21.8g/l，乳酸的含量為1.09-1.14g/l，乙酸的含量為0.64-0.68g/l。
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1.一種發(fā)酵制備5-氨基乙酰丙酸的方法，其特征在于，包括活化培養(yǎng)、一級種子培養(yǎng)、二級種子培養(yǎng)以及發(fā)酵培養(yǎng)步驟；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種發(fā)酵制備5-氨基乙酰丙酸的方法，其特征在于，
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種發(fā)酵制備5-氨基乙酰丙酸的方法，其特征在于，
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種發(fā)酵制備5-氨基乙酰丙酸的方法，其特征在于，
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種發(fā)酵制備5-氨基乙酰丙酸的方法，其特征在于，
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種發(fā)酵制備5-氨基乙酰丙酸的方法，其特征在于，
【技術(shù)特征摘要】
1.一種發(fā)酵制備5-氨基乙酰丙酸的方法，其特征在于，包括活化培養(yǎng)、一級種子培養(yǎng)、二級種子培養(yǎng)以及發(fā)酵培養(yǎng)步驟；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種發(fā)酵制備5-氨基乙酰丙酸的方法，其特征在于，
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【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：高世軍，王志強(qiáng)，倫學(xué)寧，褚玉強(qiáng)，馮偉，王子為，肖樹志，李曉磊，
申請(專利權(quán))人：山東壽光巨能金玉米開發(fā)有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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