本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)公開(kāi)了一種內(nèi)消旋二氨基庚二酸脫氫酶及其應(yīng)用。所述酶為內(nèi)消旋二氨基庚二酸脫氫酶，所述酶的氨基酸序列包括SEQ?ID?NO.1或SEQ?ID?NO.2所示的序列。本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)發(fā)現(xiàn)了來(lái)源于韌皮類(lèi)細(xì)菌酶DAPDH1以及來(lái)源于嗜熱諾瓦克氏菌的酶DAPDH2具備催化草酰乙酸合成D?天冬氨酸的功能，同時(shí)設(shè)計(jì)合成D?天冬氨酸的方法，使用一鍋法進(jìn)行三酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，能將廉價(jià)的混旋天冬氨酸或者L?天冬氨酸完全轉(zhuǎn)化為高附加值的D?天冬氨酸，實(shí)現(xiàn)綠色、環(huán)保、高效且低成本制備D?天冬氨酸，具有廣泛的工業(yè)應(yīng)用前景。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專(zhuān)利技術(shù)屬于生物，涉及一種內(nèi)消旋二氨基庚二酸脫氫酶及其應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、d-天冬氨酸在醫(yī)藥和化妝品化工領(lǐng)域有著重要的作用，以d-天冬氨酸和阿莫西林為原料，可以合成具有半衰期長(zhǎng)和血清蛋白結(jié)合率低的阿斯匹西林，且d-天冬氨酸能夠抗氧化促進(jìn)膠原蛋白的生成，減少皺紋和皮膚粗糙的形成。
2、當(dāng)前酶法合成d-天冬氨酸上主要是通過(guò)手性拆分。有報(bào)道內(nèi)消旋-二氨基庚二酸脫氫酶可以高立體選擇性地還原胺化短鏈2-酮酸如丙酮酸合成對(duì)應(yīng)的d-氨基酸，如cn115786296a公開(kāi)了一種內(nèi)消旋-二氨基庚二酸脫氫酶突變體，能高效催化草酰乙酸生成d-天冬氨酸，相較于野生型，對(duì)草酰乙酸的比酶活能提高約10.9倍；n-酰基-d-氨基酸氨基水解酶能夠立體專(zhuān)一性的催化n-酰基-d-氨基酸水解生成d-氨基酸和脂肪酸，該酶已被應(yīng)用到d-天冬氨酸的合成中；d-琥珀酰胺酶可以定向的水解n-琥珀酰-d-氨基酸生成琥珀酸和d-氨基酸，利用d-琥珀酰胺酶以n-琥珀酰-dl-天冬氨酸為底物合成d-天冬氨酸，但是其缺點(diǎn)很明顯，產(chǎn)率低，產(chǎn)物光學(xué)純度不高；l-氨基酸氧化酶能拆分混旋的氨基酸，從而獲得d-氨基酸，產(chǎn)物往往有著較高的光學(xué)純度，其中l(wèi)-天冬氨酸氧化酶(ec1.4.3.16)被用來(lái)合成d-天冬氨酸，但其理論產(chǎn)率只有50％，這限值了l-氨基酸氧化酶合成d-氨基酸的工業(yè)應(yīng)用。
3、綜上所述，挖掘新的應(yīng)用于合成d-天冬氨酸的酶，實(shí)現(xiàn)高效、低成本生產(chǎn)d-天冬氨酸，對(duì)于d-天冬氨酸應(yīng)用領(lǐng)域具有重要意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
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p>1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足與實(shí)際需求，本專(zhuān)利技術(shù)提供一種內(nèi)消旋二氨基庚二酸脫氫酶及其應(yīng)用，本專(zhuān)利技術(shù)挖掘?qū)Σ蒗Ｒ宜嵊写呋盍Φ膬?nèi)消旋二氨基庚二酸脫氫酶，以實(shí)現(xiàn)高效、低成本生產(chǎn)d-天冬氨酸。2、為達(dá)上述目的，本專(zhuān)利技術(shù)采用以下技術(shù)方案：
3、第一方面，本專(zhuān)利技術(shù)提供一種酶在催化草酰乙酸中的應(yīng)用，所述酶為內(nèi)消旋二氨基庚二酸脫氫酶，所述酶的氨基酸序列包括seq?id?no.1或seq?id?no.2所示的序列。
4、本專(zhuān)利技術(shù)中，首次發(fā)現(xiàn)來(lái)源于韌皮類(lèi)細(xì)菌(firmicutes?bacterium)的內(nèi)消旋二氨基庚二酸脫氫酶dapdh1(氨基酸序列為seq?id?no.1，accessionnumer為nln19466.1)以及來(lái)源于嗜熱諾瓦克氏菌(novibacillus?thermophilus)的內(nèi)消旋二氨基庚二酸脫氫酶dapdh2(氨基酸序列為seq?id?no.2，accessionnumer為wp_077718924.1)對(duì)草酰乙酸具有催化活力，能夠催化其合成d-天冬氨酸，具備廣闊的應(yīng)用前景。
5、可以理解，本專(zhuān)利技術(shù)發(fā)現(xiàn)了來(lái)源于韌皮類(lèi)細(xì)菌(firmicutes?bacterium)的酶dapdh1以及來(lái)源于嗜熱諾瓦克氏菌(novibacillus?thermophilus)的酶dapdh2具備催化草酰乙酸合成d-天冬氨酸的功能，那么firmicutes?bacterium、novibacillus?thermophilus或相近菌株中的序列相似且功能與seq?id?no.1或seq?id?no.2所示序列相同或相似的酶均能預(yù)期其具備催化草酰乙酸的功能，此外，利用本領(lǐng)域通用技術(shù)手段對(duì)seq?id?no.1或seq?idno.2所示序列進(jìn)行取代、缺失或添加一個(gè)或至少兩個(gè)氨基酸殘基改造而獲得的酶，同時(shí)功能與原蛋白相同或相似，亦可預(yù)期其具備催化草酰乙酸的功能。
6、seq?id?no.1：
7、maldnrlrvaiigygnvgryalkavqaapdmlltgvvrrdpktpqpselagvkvvsdirelpdtegallclptrlipqwaerilsmgintvdgydihgeladlrqrlhqvaqragsvavlscgwdpgtnsivralfelmaprgitytnygpgmslghtvavkaipgvkdalsvtipdgmgvhkravyvelepgadfqaiaeaiksdpyfvndetkvtqvedvenlidmgqgvflerkgvssetdnqlfrydirinnpaltaqimtaslraasrqkpgcytmleipvidflpgereslirrlv。
8、seq?id?no.2：
9、mnkvhkiavvgygnigkyavqalnrapdmelagvvrrarsardvppelagvpiatsidelegveaailatptrttpeyasdilskgihtvdsydihgeladvrrklddiakrhgsvaivsagwdpgtdsmirsmlefmapggvtytnfgpgmsmghsvavkaidgvkdalsmtiplgtgvhrrmvyveceagadfetvkekvladpyfvndethviqvddvqqlvdvgqgvsmerkgvsgathnqlfnfemrinnpaltsqvlvaaaratfkqqpgaytmievpiidfmygdreelikrlv。
10、第二方面，本專(zhuān)利技術(shù)提供第一方面中所述的酶在合成d-天冬氨酸中的應(yīng)用。
11、第三方面，本專(zhuān)利技術(shù)提供一種合成d-天冬氨酸的方法，所述方法包括：
12、以草酰乙酸為底物，以第一方面中所述的酶為催化劑催化生成d-天冬氨酸。
13、優(yōu)選地，所述方法包括：
14、將草酰乙酸、nadp+與第一方面中所述的酶混合，進(jìn)行反應(yīng)，得到d-天冬氨酸。
15、優(yōu)選地，所述草酰乙酸、nadp+和催化劑的質(zhì)量濃度比為1:0.1:(1～2.5)。
16、優(yōu)選地，所述反應(yīng)的溫度為20～40℃，包括但不限于21℃、22℃、23℃、25℃、30℃、35℃、36℃、38℃或39℃時(shí)間為15～25h。
17、優(yōu)選地，所述方法還包括輔酶循環(huán)的步驟，所述輔酶循環(huán)包括：
18、在反應(yīng)體系中加入甲酸脫氫酶和/或者葡萄糖脫氫酶。
19、本專(zhuān)利技術(shù)中，設(shè)計(jì)輔酶循環(huán)的步驟，能夠進(jìn)一步回收輔酶，降低成本，同時(shí)提高底物轉(zhuǎn)化率。
20、可以理解，本領(lǐng)域通用的甲酸脫氫酶或者葡萄糖脫氫酶均適用于本專(zhuān)利技術(shù)，例如可選擇來(lái)源于糞腸球菌(enterococcusfaecalis)的甲酸脫氫酶fdh，氨基酸序列的accessionnumer為esu74154.1。
21、第四方面，本專(zhuān)利技術(shù)提供一種合成d-天冬氨酸的方法，所述方法包括：
22、以l-天冬氨酸和/或混旋天冬氨酸為底物，以草酰乙酸合成酶，以及第一方面中所述的酶為催化劑催化生成d-天冬氨酸。
23、所述草酰乙酸合成酶包括l-氨基酸脫氨酶和/或l-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶。
24、可以理解，本領(lǐng)域通用的l-氨基酸脫氨酶或l-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶均適用于本專(zhuān)利技術(shù)，例如所述l-氨基酸脫氨酶或l-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶可選擇如下(a1)-(a14)中任一：
25、(a1)來(lái)源于奇異變形桿菌(proteus?mirab本文檔來(lái)自技高網(wǎng)
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【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種酶在催化草酰乙酸中的應(yīng)用，所述酶為內(nèi)消旋二氨基庚二酸脫氫酶；
2.權(quán)利要求1中所述的酶在合成D-天冬氨酸中的應(yīng)用。
3.一種合成D-天冬氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括：
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的合成D-天冬氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括：
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的合成D-天冬氨酸的方法，其特征在于，所述草酰乙酸、NADP+和催化劑的質(zhì)量濃度比為1:0.1:(1～2.5)。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的合成D-天冬氨酸的方法，其特征在于，所述反應(yīng)的溫度為20～40℃，時(shí)間為15～25h。
7.根據(jù)權(quán)利要求3-6任一項(xiàng)所述的合成D-天冬氨酸的方法，其特征在于，所述方法還包括輔酶循環(huán)的步驟，所述輔酶循環(huán)包括：
8.一種合成D-天冬氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括：
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的合成D-天冬氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括：
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的合成D-天冬氨酸的方法，其特征在于，所述方法還包括輔酶循環(huán)的步驟，所述輔酶循環(huán)包括：p>...
【技術(shù)特征摘要】
1.一種酶在催化草酰乙酸中的應(yīng)用，所述酶為內(nèi)消旋二氨基庚二酸脫氫酶；
2.權(quán)利要求1中所述的酶在合成d-天冬氨酸中的應(yīng)用。
3.一種合成d-天冬氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括：
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的合成d-天冬氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括：
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的合成d-天冬氨酸的方法，其特征在于，所述草酰乙酸、nadp+和催化劑的質(zhì)量濃度比為1:0.1:(1～2.5)。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的合成d-天冬...
【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：周峰，張躍，樂(lè)庸堂，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：上海騰卓藥業(yè)有限責(zé)任公司，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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