【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及基因工程領域，具體而言，涉及一種產金松酸基因工程菌及其構建方法與應用。
技術介紹
1、金松酸(cis-5z,11z,14z-eicosatrienoic?acid)是裸子植物中特有的脂肪酸，具有特殊的生物活性，會顯著影響胞內脂質代謝，可預防高血脂、高膽固醇、動脈粥樣硬化形成，也具有良好的抗炎作用。δ5多亞基間斷不飽和雙鍵是的主要結構特點。
2、目前，金松酸主要存在于裸子植物香榧(torreyagrandis)的種子油中，但是香榧是多年生林木，其生長周期長，油脂和脂肪酸提取工藝復雜。相對來講，微生物合成可以解決從植物中提取的缺點，具有生產工藝簡單、成本低、產品質量好等優點。
3、金松酸在生物體內通過δ5去飽和酶催化合成得到。但是，目前尚無微生物合成金松酸的方法，因此本領域迫切需要篩選到相應的δ5去飽和酶并開發一種生物合成金松酸的方法。
技術實現思路
1、本專利技術的目的在于提供一種產金松酸基因工程菌及其構建方法與應用，以解決
技術介紹
所提出的至少一個技術問題，本專利技術的具體方面包括：
2、本專利技術首先提供了香榧(torreya?grandis)來源的δ5去飽和酶，其特征在于所述酶的氨基酸序列如seq?id?no：2所示。
3、本專利技術第二方面提供了上述述δ5去飽和酶的基因(tgdes)，其特征在于，核苷酸序列如seq?id?no：1所示，或為密碼子優選后的序列如seq?id?no：6所示。
4、本專利技術第
5、在本專利技術的具體實施方式中，所述產金松酸基因工程菌的底盤細胞為解脂耶氏酵母，優選為ku70敲除的解脂耶氏酵母。
6、在本專利技術的具體實施方式中，所述基因片段在解脂耶氏酵母內源強啟動子、終止子控制下表達；優選的啟動子包含pyat1、ptefin、pgpd、pfba1和pexp；優選的終止子包含tlip2和tpex20。
7、在本專利技術的具體實施方式中，egd9es為多拷貝導入。
8、在本專利技術的具體實施方式中，所述基因工程菌包含me3s-egd9es基因片段；優選地，所述片段插入ku80位點。
9、在本專利技術的具體實施方式中，所述基因工程菌包含fmd12s-egd9es基因片段，優選地，所述片段插入intc-2位點。
10、在本專利技術的具體實施方式中，tgdes基因片段插入intc-3位點。
11、本專利技術第四方面提供上述產金松酸基因工程菌的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：
12、構建包含mortierella?alpina來源的基因c16/18脂肪酸延長酶(me3s)，euglenagracilis來源的基因δ9延長酶(egd9es)以及解脂耶氏酵母內源強啟動子、終止子的功能元件表達盒；將表達盒整合至解脂耶氏酵母基因組上的ku80位點，獲得重組解脂耶氏酵母菌株yl-1；
13、構建包含fusarium?monoliforme來源的基因δ12去飽和酶(fmd12s)，euglenagracilis來源的基因δ9延長酶(egd9es)以及解脂耶氏酵母內源強啟動子、終止子的功能元件表達盒；將表達盒整合至菌株yl-1基因組上的intc-2位點獲得重組解脂耶氏酵母菌株yl-2；
14、構建包含torreyagrandis來源的基因δ5去飽和酶基因(tgdes)以及解脂耶氏酵母內源強啟動子、終止子的功能元件表達盒；將表達盒整合至菌株yl-2基因組上的intc-3位點獲得重組解脂耶氏酵母菌株yl-3，即產金松酸基因工程菌株。
15、第五方面，本專利技術提供了一種合成金松酸的方法，采用本專利技術第三方面所述的產金松酸基因工程菌或本專利技術第四方面所述方法構建的解脂耶氏酵母菌株yl-3發酵合成金松酸。
16、技術效果：
17、(1)本專利技術以解脂耶氏酵母為底盤細胞，將金松酸表達模塊線性化后轉入解脂耶氏酵母體內并利用crispr/cas9技術介導整合到設計的染色體位置，具有簡單快速高效的優點，2～3周即可獲得整合工程菌株，明顯縮短工程菌構建周期。
18、(2)本專利技術可利用簡單培養基發酵生產非常規脂肪酸金松酸，所得工程菌可利用葡萄糖、甘油等簡單碳源進行金松酸的發酵生產，有較好的應用前景。
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1.香榧(Torreyagrandis)來源的Δ5去飽和酶，其特征在于所述酶的氨基酸序列如SEQID?NO：2所示。
2.編碼權利要求1所述Δ5去飽和酶的基因(TgDES)，其特征在于，核苷酸序列如SEQ?IDNO：1所示，或為密碼子優選后的序列如SEQ?ID?NO：6所示。
3.一種產金松酸基因工程菌，其特征在于，所述產金松酸基因工程菌含有并能夠表達基因ME3S、EgD9eS、FmD12S以及TgDES，所述基因ME3S、EgD9eS、FmD12S和TgDES的核苷酸序列分別如SEQ?ID?No：3、SEQ?ID?No：4、SEQ?ID?No：5以及SEQ?ID?No：6所示。
4.如權利要求3所述的產金松酸基因工程菌，其底盤細胞為解脂耶氏酵母。
5.如權利要求3所述的產金松酸基因工程菌，所述基因ME3S、EgD9eS、FmD12S和TgDES在解脂耶氏酵母內源強啟動子、終止子控制下表達；優選的啟動子包含pYAT1、pTEFIN、pGPD、pFBA1和pEXP；優選的終止子包含tLIP2和tPEX20。
6.如權利要求
7.如權利要求3所述的產金松酸基因工程菌，所述基因工程菌包含ME3S-EgD9eS基因片段；優選地，所述片段插入KU80位點。
8.如權利要求3所述的產金松酸基因工程菌，所述基因工程菌包含FmD12S-EgD9eS基因片段，優選地，所述片段插入IntC-2位點。
9.如權利要求3所述的產金松酸基因工程菌，TgDES基因片段插入IntC-3位點。
10.如權利要求3所述的產金松酸基因工程菌的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：
11.一種合成金松酸的方法，其特征在于，采用權利要求3所述的產金松酸基因工程菌或權利要求10所述方法構建的解脂耶氏酵母菌株YL-3發酵合成金松酸。
...【技術特征摘要】
1.香榧(torreyagrandis)來源的δ5去飽和酶，其特征在于所述酶的氨基酸序列如seqid?no：2所示。
2.編碼權利要求1所述δ5去飽和酶的基因(tgdes)，其特征在于，核苷酸序列如seq?idno：1所示，或為密碼子優選后的序列如seq?id?no：6所示。
3.一種產金松酸基因工程菌，其特征在于，所述產金松酸基因工程菌含有并能夠表達基因me3s、egd9es、fmd12s以及tgdes，所述基因me3s、egd9es、fmd12s和tgdes的核苷酸序列分別如seq?id?no：3、seq?id?no：4、seq?id?no：5以及seq?id?no：6所示。
4.如權利要求3所述的產金松酸基因工程菌，其底盤細胞為解脂耶氏酵母。
5.如權利要求3所述的產金松酸基因工程菌，所述基因me3s、egd9es、fmd12s和tgdes在解脂耶氏酵母內源強啟動子、終止子控制下表達...
【專利技術屬性】
技術研發人員：宋麗麗，高雅迪，吳家勝，江會鋒，婁和強，郇偉偉，
申請(專利權)人：浙江農林大學，
類型：發明
國別省市：
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