一種檢測三聚氰胺含量的膠體硒試紙條制造技術

本發明專利技術為一種檢測三聚氰胺含量的膠體硒試紙條。該試紙條主要由支撐板、樣品采樣區、硒標結合區、顯色反應區、吸水墊等部分組成。依據抗原抗體特異結合、免疫層析顯色標記等原理，建立由膠體納米硒顆粒標記的抗三聚氰胺的單克隆抗體與三聚氰胺特異反應顯色體系，并通過抗原與抗體競爭反應顯色，建立樣品中三聚氰胺含量與檢測帶顯色的對應關系，從而可以依據顯色區中條帶是否顯色來判斷樣品中是否含有三聚氰胺或對其進行半定量。本項發明專利技術具有特異性強、靈敏性高、檢測速度快、操作簡單、方便攜帶等優點，能夠快速、靈敏地判斷出所測樣本如牛奶、飼料、畜產品、血液、尿液等中是否含有三聚氰胺或其含量是否超標，從而對食品安全和人們正常身體健康作出評估判斷。適合牛奶、飼料、畜產品、血液等的現場快速篩查，也可以用于家庭日常生活自檢和人自身的三聚氰胺含量檢測。

【技術實現步驟摘要】

本項專利技術為一種檢測三聚氰胺含量的膠體硒試紙條。具體來說是一種利用單克隆抗體技 術、硒標抗體技術和免疫層析技術組裝起來的可快速檢測血清、尿液、牛奶等樣品中三聚氰 胺的半定量試紙條，屬于生物
二
技術介紹
三聚氰胺(Melamine)，是一種三嗪類含氮雜環有機化合物，主要的用途是作為生產三 聚氰胺甲醛樹脂的原料用于制造日用器皿、裝飾貼面板、織物整理劑等。已有研究表明，長期攝取三聚氰胺可能造成人體或動物生殖能力損害、膀胱或腎結石、 甚至導致膀胱癌。2007年，美國爆發寵物食品受污染事件，造成部分寵物貓狗發生嚴重腎衰竭而死亡。事 后經調査表明導致寵物中毒的原因主要是因為寵物食品摻雜了《6. 6%三聚氰胺的小麥蛋白 粉。2008年9月，中國爆發三鹿嬰幼兒奶粉受污染事件，導致食用了受污染奶粉的嬰幼兒產 生腎結石病癥，其主要原因就是奶粉中含有嚴重超標的三聚氰胺。隨后在奶糖、油條、雞蛋 等食品中也發現含有三聚氰胺，給人們身體健康造成嚴重威脅。因此人體內、食品中及畜產品中殘留的三聚氰胺含量檢測已經成為食品安全和人身健康 的一項常規檢測指標，日益受到重視。現有的檢測三聚氰胺的方法主要是用色譜法如GC-MS、 HPLC、 HC-MS等，但是這些方法需 要完備的實驗室、專門的操作人員、昂貴的分析儀器、繁雜的檢測步驟和不菲的檢測費用， 不適合現場進行大批量的快速檢測，更不適合用于普通的家庭自檢使用。因此亟需開發一種 靈敏性高、檢測迅速、特異性高、成本低廉、適合現場即時檢測的三聚氰胺檢測方法。而目 前基于免疫學原理的ELISA三聚氰胺檢測試劑盒，依舊沒能擺脫儀器的束縛，費用也較高， 耗時需要1一2個小時，再加上它用的是多克隆抗體，特異性并不高。本項專利技術則是基于免疫學原理，研發出針對三聚氰胺的單克隆抗體，再研制成硒標三聚 氰胺快速檢測試紙條。該試紙條具有特異性強、靈敏性高、檢測速度快、不需要任何儀器設 備、不需要專業人員操作、運行費用低廉、攜帶方便等特點，可快速檢測血清、尿液、牛奶等樣品中三聚氰胺，尤其適合現場樣品的即時快速檢測和家庭自檢使用。
技術實現思路
本專利技術為一種檢測三聚氰胺含量的膠體硒試紙條，它是一種半定量快速檢測試紙條。其 原理是用抗三聚氰胺單克隆抗體檢測待檢樣品中的三聚氰胺，從而提高了檢測的特異性、靈 敏性，避免了已有的ELISA檢測試劑盒所采用的普通抗三聚氰胺抗體檢測三聚氰胺時特異性 和靈敏性差的不足。利用膠體納米硒顆粒標記抗三聚氰胺單克隆抗體，提高了其檢測結果可 視性，進一步提高了靈敏性，并且膠體納米硒顆粒制備要求并不如膠體納米金嚴格，降低了 制備該試紙條有效性所需要求條件，拓寬了試紙條有效性檢測所需條件范圍，擺脫了特定儀 器的束縛，降低了成本要求，使得該試紙條的使用對象更加大眾化。在本項專利技術中，首先通過用三聚氰胺免疫抗原MEL-KLH (三聚氰胺偶聯血藍蛋白)免疫 小鼠，獲得能分泌抗三聚氰胺抗體的小鼠脾細胞，讓其與事先馴化好的SP2/0細胞融合，采 用有限稀釋法進行篩選單克隆細胞并擴大培養，然后將篩選出來的分泌抗三聚氰胺單克隆抗 體的融合細胞注射小鼠，使其產生腹水。采集腹水，進行抗體提純即可獲得抗三聚氰胺單克 隆抗體。其后以亞硒酸和抗壞血酸為原料制得膠體納米硒顆粒，按照最佳條件將抗三聚氰胺單克 隆抗體進行膠體納米硒標記。將硒標抗三聚氰胺單克隆抗體噴涂在硒標結合區的玻璃纖維上 ，將一定濃度(10yg/L)的三聚氰胺包被抗原MEL-BSA (三聚氰胺偶聯牛血清白蛋白)噴涂 在反應顯色區上，同時在質控帶上則噴涂一定濃度的羊抗鼠IgG抗體。將支撐板、噴涂有三 聚氰胺包被抗原MEL-BSA的檢測帶和羊抗鼠IgG抗體的質控帶的硝酸纖維素濾膜、噴涂有硒標 抗三聚氰胺單克隆抗體的玻璃纖維、吸水墊的濾紙和采樣區的玻璃纖維按照說明書附圖1順 序組裝好。測試時，把樣品(牛奶或血清、尿液)滴于該試紙條的采樣區，樣品由于毛細作用進行 側向層析作用，首先經過硒標結合區，若樣品中存在三聚氰胺，則三聚氰胺就會和結合區玻 璃纖維上的硒標抗三聚氰胺單克隆抗體特異結合，形成硒標抗原抗體復合物。這種復合物會 繼續隨著樣品進行側向層析作用，當經過硝酸纖維素濾膜上的檢測帶時，檢測帶上的三聚氰 胺包被抗原MEL-BSA也會和硒標抗三聚氰胺單克隆抗體進行抗原抗體特異反應。不過當樣品 中的三聚氰胺濃度含量達到或超過臨界濃度(10yg/L)時，其會把硒標抗三聚氰胺單克隆 抗體上的結合位點全部占據，從而使得檢測帶上的三聚氰胺包被抗原MEL-BSA不能夠和硒標 抗原抗體復合物再進行結合，從而使得檢測帶不顯色，而當樣品中沒有或濃度沒有達到三聚4氰胺臨界濃度(10yg/L)時，檢測帶上的三聚氰胺包被抗原MEL-BSA會和硒標抗三聚氰胺單 克隆抗體結合，從而使得檢測帶顯色。然后這種硒標抗原抗體復合物在硝酸纖維素濾膜上繼 續前進，與質控帶上的羊抗鼠IgG抗體繼續結合進而顯色(見說明書附圖2)。這樣通過兩條 帶顯色與否，就可以便捷、快速、靈敏地檢測出樣品中三聚氰胺的含量水平。該種方法具有 便捷化、靈敏化、特異化、適時化、快速化、大眾化等特點，非常適合現場樣品的即時快速 檢測，也適合家庭日常生活中人體體液中三聚氰胺的快速檢測和食品自檢等。 四、說明書附圖說明說明書附圖1為三聚氰胺含量快速檢測試紙條結構示意圖。① 為支撐板，主要成份為PVC板；② 為采樣區，主要成份為玻璃纖維。，主要作用為采集樣品；③ 為硒標結合區，主要成份為浸泡過硒標抗三聚氰胺單克隆抗體的玻璃纖維；④ 為反應顯色區，主要成份為硝酸纖維素濾膜，上面包括檢測帶和質控帶；⑤ 為噴涂包被有三聚氰胺包被抗原MEL-BSA的檢測帶；⑥ 為噴涂包被有羊抗鼠IgG的質控帶；⑦ 為吸水墊，主要成分為濾紙提供吸水作用及手柄作用。說明書附圖2為三聚氰胺含量快速檢測試紙條檢測結果說明圖。①檢測結果為陽性的， 檢測帶不顯色，而質控帶顯色，說明樣品中含有三聚氰胺且含量水平已經超過10yg/L;② 檢測結果為陰性，檢測帶顯色，質控帶也顯色，說明樣品中不含有三聚氰胺或其含量水平還 未超過10yg/L。③為試紙條失效時的情況，即檢測帶不顯色，質控帶也不顯色，說明該試 紙條已經失效，須更換一個新的試紙條重新檢測。五具體實施例方式實施例l抗三聚氰胺單克隆抗體的制備1) 用三聚氰胺免疫抗原MEL-KLH (三聚氰胺偶聯血藍蛋白)免疫BALB/C小鼠，經過三次 免疫后，測小鼠血清抗體效價，經過加強免疫后，取效價高那只小鼠為脾細胞提供者。2) 用8-雜氮鳥嘌呤馴化SP2/0細胞，待其馴化好后，按照經典動物細胞融合法將SP2/0 細胞與體內產生高的抗體水平的小鼠脾細胞進行融合。3) 然后用三聚氰胺包被抗原MEL-BSA(三聚氰胺偶聯牛血清白蛋白)包被酶標板，間接 ELISA法檢測能夠分泌抗三聚氰胺抗體的融合細胞，并按照有限稀釋法進行亞克隆，直到篩 選出能夠成功分泌抗三聚氰胺單克隆抗體的穩定的融合細胞株。4) 將篩選出的穩定的能夠分泌抗三聚氰胺單克隆抗體的陽性細胞株進行擴大培養，并 將其注射進事先經過石蠟馴化的純系BALB/C小鼠腹腔內，使其產生大量含有分泌抗三聚氰胺 單克隆抗體的腹水。5) 將收集到的腹水進行濃縮、提純，進而得到抗三聚氰本文檔來自技高網...

【技術保護點】
本項專利技術所述的一種檢測三聚氰胺含量的膠體硒試紙條，主要結構包括支撐板，采樣區，硒標結合區，反應顯色區，吸水墊等部分。其主要特征在于硒標結合區包被有硒標抗三聚氰胺單克隆抗體，檢測帶包被有三聚氰胺包被抗原ＭＥＬ－ＢＳＡ。利用競爭法原理使得樣品中的三聚氰胺跟檢測帶上的三聚氰胺包被抗原ＭＥＬ－ＢＳＡ競爭與硒標抗三聚氰胺單克隆抗體結合顯色，從而可以判斷出所檢樣品中是否含有三聚氰胺或對其進行半定量。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：李紅玉，徐志良，
申請(專利權)人：李紅玉，蘭州大學，
類型：發明
國別省市：62[中國|甘肅]