【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于癌癥發病相關基因檢測領域，更具體地說是本專利技術以fam210b基因在多發性骨髓瘤病人外周血中明顯上調表達為基礎，涉及一種基于fam210b基因的多發性骨髓瘤診斷試劑盒及fam210b基因在制備多發性骨髓瘤診斷試劑盒中的應用，本專利技術也涉診斷多發性骨髓瘤的方法。
技術介紹
1、多發性骨髓瘤被認為是漿細胞惡性增殖性疾病，其特征是漿細胞不受控制的增殖和單克隆抗體的產生。多發性骨髓瘤細胞起源于骨髓中的漿細胞，而漿細胞是b淋巴細胞發育到最終功能階段的細胞。因此多發性骨髓瘤可以歸到b淋巴細胞淋巴瘤的范圍。其特征為骨髓漿細胞異常增生伴有單克隆免疫球蛋白或輕鏈(m蛋白)過度生成，極少數患者可以是不產生m蛋白的未分泌型mm。多發性骨髓瘤常伴有多發性溶骨性損害、高鈣血癥、貧血、腎臟損害。由于正常免疫球蛋白的生成受抑，因此容易出現各種細菌性感染。
2、多發性骨髓瘤發病率估計為2～3/10萬，男女比例為1.6：1，大多患者年齡>40歲。近年來，臨床調查發現多發性骨髓瘤發病率顯著增加。據估計，2020年美國的發病率高達4-6/10萬例，新增病例32270例，死亡報告12830例，其中非洲裔美國人的發病率是歐洲裔美國人的2-3倍。
3、眾所周知，多發性骨髓瘤和其他惡性疾病患者經歷了從無癥狀到有癥狀的漸進過程，這也被稱為非惡性到惡性階段。這個漸進過程伴隨著許多遺傳基因的表達改變。通過與多發性骨髓瘤相關基因表達的檢測，可以給多發性骨髓瘤進行早期診斷提供依據，制備以相應基因為基礎的檢測方法。
4、然而，
5、本專利技術通過對健康人和多發性骨髓瘤病人臨床樣本進行高通量mrna表達譜測序分析，發現fam210b是多發性骨髓瘤患者中一個高度表達的新基因。我們前期實驗研究表明，fam210b基因過表達可以促進多發性骨髓瘤細胞增殖和小鼠體內移植瘤的發生、發展。因此，該基因可能成為多發性骨髓瘤一個新的診療靶點。
技術實現思路
1、為了彌補現有多發性骨髓瘤診斷靶點的不足，本專利技術的目的在于提供一種基于fam210b基因的定量聚合酶鏈式反應(qpcr)擴增試劑盒及其在多發性骨髓瘤診斷中的應用。
2、為了實現上述目的，本專利技術采用如下技術方案：
3、本專利技術通過對健康人和多發性骨髓瘤病人外周血細胞樣本進行高通量mrna表達譜測序分析，發現fam210b是多發性骨髓瘤患者中一個高度表達的新基因。通過檢測fam210b基因轉錄水平的表達情況，可以判斷受試者是否患有多發性骨髓瘤。
4、由于fam210b基因的在多發性骨髓瘤患者外周血細胞樣本中轉錄水平較健康人外周血細胞樣本明顯升高，可以根據這一特點，以fam210b基因為基礎為制備基于fam210b基因的多發性骨髓瘤診斷試劑盒提供依據。fam210b基因在制備基于fam210b基因的多發性骨髓瘤診斷試劑盒中的應用，其特征在于所述診斷試劑盒包含使用qpcr擴增fam210b基因用的引物對，所述引物分別為：
5、上游引物序列：5’-tctctgatgcagggcacttg-3’，如seq?id?no：1所示；
6、下游引物序列：5’-ctcagcacgc?tcctgttact-3’，如seq?id?no：2所示。
7、本專利技術的另一目的是提供一種基于fam210b基因的多發性骨髓瘤診斷試劑盒，所述試劑盒包含qpcr擴增fam210b基因用的引物，引物可以根據引物設計的常規設計原則設計。優選的實施方案中所述引物分別為：
8、上游引物序列：5’-tctctgatgcagggcacttg-3’，如seq?id?no：1所示；
9、下游引物序列：5’-ctcagcacgc?tcctgttact-3’，如seq?id?no：2所示。
10、所述診斷試劑盒還包含管家基因β-actin引物，引物對可以根據引物設計的常規設計原則設計。優選的實施方案中所述引物分別為：
11、上游引物序列：5’-ctcgcctttgccgatcc-3’，如seq?id?no：3所示；
12、下游引物序列：5’-ggggtacttcagggtgagga-3’,如seq?id?no：4所示。
13、所述診斷試劑盒還包含qpcr擴增反應體系，所述qpcr擴增反應體系包含sybrgreen熒光染料、pcr緩沖液、dntps。
14、上述技術方案中，所述pcr緩沖液為本領域的公知現有技術，優選地，pcr緩沖液包含：200mm(nh4)2so4、20mm?kcl、2.5mm?mgcl2。
15、在本專利技術的一個具體實施方案中，本專利技術的診斷試劑盒還包含m-mlv逆轉錄體系，該逆轉錄體系包含：、逆轉錄反應液、m-mlv逆轉錄酶、rna酶抑制劑、dntps、oligo(dt)。
16、優選逆轉錄反應液包含：15mm的mgcl2、370mm的kcl、250mm?ph8.3的tris-hcl、50mm的dtt。
17、rna酶抑制劑可選用本領域常用的rna酶抑制劑，優選為大腸桿菌表達的重組rna蛋白酶抑制劑。
18、在本專利技術的一個具體的實施方案中，本專利技術的診斷試劑盒還包含rna提取試劑，rna提取試劑包含trizol、氯仿、異丙醇、75％乙醇。
19、本專利技術的診斷試劑盒保存于-20℃，盡量減少反復凍融。
20、本專利技術還提供了診斷多發性骨髓瘤的方法，所述方法包括：
21、(1)利用rna提取試劑提取樣本總rna；
22、(2)將步驟(1)獲得的rna逆轉錄成cdna；
23、(3)在qpcr儀上將fam210b基因和管家基因進行擴增；
24、(4)通過融解曲線分析和電泳確定目的條帶，δδct法進行相對定量；
25、(5)fam210b基因表達升高，表明研究對象為多發性骨髓瘤患者。
26、本專利技術的優點和有益效果在于：
27、(1)本專利技術首次發現了fam210b與多發性骨髓瘤的關系，通過檢測受試者中fam210b基因表達的水平，可以判斷其是否患有多發性骨髓瘤，從而指導臨床醫師給受試者提供預防方案或者治療方案；
28、(2)本專利技術首次為以fam210b基因為靶點在制備診斷試劑盒或治療試劑等方面提供依據；
29、(2)本專利技術發現fam210b診斷試劑盒診斷多發性骨髓瘤，相比現有的診斷手段，該方法準確性高、副作用低，有利于實現多發性骨髓瘤的早期篩查及準確判斷是否多發性骨髓瘤。
本文檔來自技高網...【技術保護點】
1.一種基于FAM210B基因的定量聚合酶鏈式反應(qPCR)擴增試劑盒在多發性骨髓瘤診斷中的應用，其特征在于，所述診斷試劑盒包含可用于擴增FAM210B基因的qPCR引物，所述引物分別為：
2.一種基于FAM210B基因的多發性骨髓瘤診斷試劑盒，其特征在于，所述診斷試劑盒包含FAM210B基因的qPCR引物，所述引物分別為：
3.根據權利要求2所述的診斷試劑盒，其特征在于，所述診斷試劑盒還包含管家基因β-actin引物對，所述引物分別為：
4.根據權利要求1-3所述的診斷試劑盒，其特征在于，所述診斷試劑盒還包qPCR的反應體系：SYBR?Green熒光染料、PCR緩沖液、dNTPs。
5.根據權利要求1-4所述的診斷試劑盒，其特征在于，所述PCR緩沖液包含：200mM(NH4)2SO4、20mM?KCL、2.5mM?MgCL2。
6.根據權利要求1-5中任一項所述的診斷試劑盒，其特征在于，所述診斷試劑盒還包含M-MLV逆轉錄體系；所述逆轉錄體系包含T重復寡核苷酸OligodT、M-MLV逆轉錄酶、RNA酶抑制劑、dNT
7.根據權利要求1-6中任一項所述的診斷試劑盒，其特征在于，所述診斷試劑盒還包含RNA提取試劑，所述RNA提取試劑包含Trizol、氯仿、異丙醇、75％乙醇。
...【技術特征摘要】
1.一種基于fam210b基因的定量聚合酶鏈式反應(qpcr)擴增試劑盒在多發性骨髓瘤診斷中的應用，其特征在于，所述診斷試劑盒包含可用于擴增fam210b基因的qpcr引物，所述引物分別為：
2.一種基于fam210b基因的多發性骨髓瘤診斷試劑盒，其特征在于，所述診斷試劑盒包含fam210b基因的qpcr引物，所述引物分別為：
3.根據權利要求2所述的診斷試劑盒，其特征在于，所述診斷試劑盒還包含管家基因β-actin引物對，所述引物分別為：
4.根據權利要求1-3所述的診斷試劑盒，其特征在于，所述診斷試劑盒還包qpcr的反應體系：sybr?green熒光染料、pcr緩沖液、dntps。
5....
【專利技術屬性】
技術研發人員：王仁喜，粟文婷，徐雅琪，張敏，朱改只，高冉，曾琦，邱金明，卞子晴，
申請(專利權)人：首都醫科大學，
類型：發明
國別省市：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。