【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物醫藥產業領域，尤其涉及一種mrna表達載體、其構建方法和應用。
技術介紹
1、mrna技術是生物醫藥產業領域近幾年發展最迅猛的技術之一，其技術優勢和商業潛力已經被mrna-1273和bnt162b2等新冠疫苗充分證實，利用mrna技術制作傳染病預防性疫苗或腫瘤等疾病的治療性疫苗或藥物已越來越常見。
2、mrna技術的產業化離不開體外轉錄技術(ivt)的發展，質粒作為體外轉錄的主要原料之一，直接影響著mrna的產業化生產。為了更好的利用mrna技術開發疫苗和藥物，本申請設計了一種既能在細胞中高效表達蛋白質，又能在體外高效轉錄的載體質粒。該質粒序列包括負責質粒在原核細胞內復制和擴增的區域和負責質粒所攜帶的基因轉錄的區域；其中參與質粒復制和擴增的區域主要包括復制子和抗性基因等元件，負責基因轉錄的區域包括啟動子、加帽位點、5’-非翻譯區(5’utr)、基因編碼序列(cds)、3’非翻譯區(3’utr)、多聚腺苷(poly?a)區和線性化酶切位點等原件。
技術實現思路
1、本專利技術提供了一種新型的mrna載體、其制備方法和應用。
2、本專利技術提供一種mrna表達載體，其包括從5’端至3’端的如下元件：
3、5’utr、編碼目的蛋白的開放閱讀框、3’utr以及poly?a；
4、其中，5’utr選自cyba、den2、hhbb、rpl38、rps25、tcv或top；
5、3’utr選自hhba1、hhbb、by
6、poly?a為選自60a、100a、30a-10x-70a、30a-10x-70a-10c-a或40a-10x-60a-10c-a。
7、優選地，5’utr為cyba、den2或hhbb，3’utr為hhbbx2，poly?a為100a或30a-10x-70a。
8、具體實施方式中，其是非復制型mrna表達載體或復制型mrna表達載體。
9、更具體地，其適用于在原核生物擴繁，尤其適用于在大腸桿菌擴繁，進一步地，所述載體采用puc復制子；或者適用于真核生物表達目的蛋白。
10、所述載體還包括啟動子；具體為cmv啟動子或t7啟動子，或串聯的cmv啟動子和t7啟動子；還攜帶抗性基因，例如卡那霉素抗性基因、氨芐青霉素抗性基因、四環素抗性基因。
11、具體地，所述mrna表達載體的骨架為pkl載體骨架。
12、進一步地，所述載體還包括下述任意之一的元件：加帽位點、酶切位點、信號肽表達元件、標簽蛋白元件。
13、在一個具體實施方式中，所述載體的骨架為pkl載體骨架。
14、在具體實施方式中，所述表達載體包含能夠表達選自以下組中至少一種的目的蛋白的mrna：是酶、抗原蛋白、抗體蛋白、診斷或治療性蛋白或藥物；優選地，所述目的蛋白選自人乳頭瘤病毒(hpv)蛋白、呼吸道合胞病毒(rsv)蛋白、或新型冠狀病毒蛋白。
15、本專利技術還提供所述的mrna表達載體在表達目的蛋白或制備mrna中的應用。
16、具體地，其是在體內表達目的蛋白，或在體外獲得編碼目的蛋白的mrna。所述編碼目的蛋白或rna沒有特別限制，可以是用于治療用途的蛋白或rna，以及其他用途的蛋白或rna。
17、本專利技術還提供一種含有所述的mrna表達載體制得的mrna分子的組合物，其由所述mrna分子以包裝體形式存在，或者還含有遞送所述mrna分子的遞送系統，或者藥學上可接受的運載體；例如，所述遞送系統適用的呼吸道遞送、滴鼻、口服、注射、黏膜給藥。
18、在一個具體實施方式中，所述組合物中的mrna分子為mrna疫苗，更具體地，所述mrna疫苗包含編碼人乳頭瘤病毒蛋白、呼吸道合胞病毒蛋白、或新型冠狀病毒蛋白的mrna分子。
19、本申請通過優化不同5’utr、3’utr和poly?a的組合，對luci蛋白表達影響不同，其中有5個組合整體表現優于bnt162b2的5’utr、3’utr和poly?a組合。5種組合的5’utr-3’utr-poly?a分別為cyba-hhbbx2-100a、den2-hhbbx2-100a、hhbb-hhbbx2-100a、den2-hhbbx2-30a-10x-70a、hhbb-hhbbx2-30a-10x-70a(10x序列為gctcacgtct)。
20、為了驗證上述質粒的譜適性，本專利技術也采用上述最佳的5’utr、3’utr和poly?a的組合用于表達hpv、rsv和新型冠狀病毒蛋白的mrna疫苗，效果表現良好，如此進一步驗證了本專利技術構建的特定的5’utr、3’utr和poly?a的組合，及其質粒具有譜適性，可用于表達各種不同的mrna。因此，本專利技術通過特定的5’utr、3’utr和poly?a的組合，可以大幅提高目的蛋白和rna的產量。本專利技術的mrna表達載體可用于制備酶、抗原蛋白、抗體蛋白、診斷或治療性蛋白或藥物以及mrna疫苗，具有較大應用價值。
本文檔來自技高網...【技術保護點】
1.一種mRNA表達載體，其特征在于，其包括從5’端至3’端的如下元件：5’UTR、編碼目的蛋白的開放閱讀框、3’UTR和poly?A；
2.如權利要求1所述的mRNA表達載體，其特征在于，5’UTR元件為CYBA、DEN2或hHBB，3’UTR元件為hHBBx2，poly?A為100A或30A-10X-70A。
3.如權利要求1或2所述的mRNA表達載體，其特征在于，其是非復制型mRNA表達載體或復制型mRNA表達載體。
4.如權利要求1至3任一項所述的mRNA表達載體，其特征在于，其適用于在原核生物擴繁，尤其適用于在大腸桿菌擴繁，進一步地，所述載體采用pUC復制子；或者適用于真核生物表達目的蛋白。
5.如權利要求1所述的mRNA表達載體，其特征在于，還包括啟動子；具體為CMV啟動子或T7啟動子，或串聯的CMV啟動子和T7啟動子；還攜帶抗性基因，例如卡那霉素抗性基因、氨芐青霉素抗性基因、四環素抗性基因。具體地，所述mRNA表達載體的骨架為pKL載體骨架。
6.如權利要求1所述的mRNA表達載體，其特征在于，還包括下述任
7.如權利要求1所述的mRNA表達載體，其特征在于，所述表達載體包含能夠表達選自以下組中至少一種目的蛋白的mRNA：酶、抗原蛋白、抗體蛋白、診斷或治療性蛋白或藥物。
8.如權利要求1至7任一項所述的mRNA表達載體在表達目的蛋白或RNA中的應用。
9.如權利要求8所述的應用，其特征在于，其是在體內表達目的蛋白，或在體外獲得編碼目的蛋白的mRNA。
10.一種含有如權利要求1至7任一項所述的mRNA表達載體制得的mRNA分子的組合物，其特征在于，由所述mRNA分子以包裝體形式存在，或者還含有遞送所述mRNA分子表達載體的遞送系統，或者藥學上可接受的運載體；例如，所述遞送系統適用的呼吸道遞送、滴鼻、口服、注射、黏膜給藥；
...【技術特征摘要】
1.一種mrna表達載體，其特征在于，其包括從5’端至3’端的如下元件：5’utr、編碼目的蛋白的開放閱讀框、3’utr和poly?a；
2.如權利要求1所述的mrna表達載體，其特征在于，5’utr元件為cyba、den2或hhbb，3’utr元件為hhbbx2，poly?a為100a或30a-10x-70a。
3.如權利要求1或2所述的mrna表達載體，其特征在于，其是非復制型mrna表達載體或復制型mrna表達載體。
4.如權利要求1至3任一項所述的mrna表達載體，其特征在于，其適用于在原核生物擴繁，尤其適用于在大腸桿菌擴繁，進一步地，所述載體采用puc復制子；或者適用于真核生物表達目的蛋白。
5.如權利要求1所述的mrna表達載體，其特征在于，還包括啟動子；具體為cmv啟動子或t7啟動子，或串聯的cmv啟動子和t7啟動子；還攜帶抗性基因，例如卡那霉素抗性基因、氨芐青霉素抗性基因、四環素抗性基因。具...
【專利技術屬性】
技術研發人員：楊建國，吳依昕，李文華，王雪，叢麗圓，劉玉瑩，伍樹明，張海江，劉永江，
申請(專利權)人：北京康樂衛士生物技術股份有限公司，
類型：發明
國別省市：
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