【技術實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術涉及類器官培養(yǎng)領域，具體涉及基于卵巢癌臨床穿刺樣本構建類器官的組合物，還涉及利用組合物構建類器官的方法。
技術介紹
1、類器官是一種3d細胞培養(yǎng)模型，因其3d結構更接近人類生物自2009年被hansclevers等創(chuàng)建該技術以來，隨著科學家們對類器官技術的不斷深耕，3d類器官模型技術與2d細胞培養(yǎng)技術相比，可以更進一步實現(xiàn)成功率更高的從腫瘤組織個性化的模型，從而實現(xiàn)個性化用藥方案的篩選。
2、卵巢癌是女性第八大致死癌癥，在我國，卵巢癌(ovarian?cancer，oc)年發(fā)病率居女性生殖系統(tǒng)腫瘤第3位，位于子宮頸癌和子宮體惡性腫瘤之后，呈逐年上升的趨勢，而病死率位于女性生殖道惡性腫瘤之首，是嚴重威脅女性健康的惡性腫瘤，且惡性程度高，易發(fā)生轉(zhuǎn)移。目前，70％上皮性卵巢癌患者在初始治療后的三年內(nèi)復發(fā)。復發(fā)次數(shù)增多、間隔時間逐漸縮短，導致患者隨之從化療敏感變至耐藥最終導致治療失敗。卵巢惡性腫瘤包括多種病理類型，其中最常見的是上皮性卵巢癌(epithelial?ovarian?cancer，eoc)，約占卵巢惡性腫瘤的80％，其次是惡性生殖細胞腫瘤和性索間質(zhì)腫瘤，各約占10％和5％。
3、不同組織學類型的卵巢癌表現(xiàn)出不同類型的代謝變化，包括化學耐藥、化學敏感、強侵襲性和弱侵襲性細胞，所以確認患者病理分型對臨床用藥具有重要意義，獲取活檢標本是確認病例分型的有效途徑。獲取活檢標本的途徑有腹腔鏡手術、開腹手術、超聲引導下穿刺活檢(core-needle?biopsy，cnb)等。腹腔鏡手術和開腹手術需要全身
4、目前，針對組織量大的卵巢癌類器官的構建技術相對成熟，多由各種類型膠原酶解離組織得到卵巢癌原代細胞，然而由于穿刺樣本較小，膠原酶在酶解時酶解反應劇烈，對細胞放入損傷較大，易產(chǎn)生大量死細胞，因此膠原酶在處理穿刺樣本時，會損失大量原代細胞，影響后續(xù)類器官的產(chǎn)量。基于此，建立一種卵巢癌穿刺樣本的類器官構建方法，尤為重要。
技術實現(xiàn)思路
1、有鑒于此，本專利技術的目的之一在于提供一種基于卵巢癌臨床穿刺樣本構建類器官的組合物；本專利技術的目的之二在于提供利用所述的組合物構建類器官的方法。
2、為達到上述目的，本專利技術提供如下技術方案：
3、1、基于卵巢癌臨床穿刺樣本構建類器官的組合物，所述組合物包括樣本保存液和樣本培養(yǎng)基；
4、所述樣本保存液各組分如下：在1-20μm?necrostatin-1，15-40mm?glutamax，0.5-3％青霉素-鏈霉素-兩性霉素b，余量為advanced?dmem/f12；
5、所述樣本培養(yǎng)基各組分如下：0.5-3mm?sodium?pyruvate，10-50mm?hepes，10-50mm?glutamax，100-300μg/ml?primocin，10-200nm?17-βestradiol，200-1000ng/mlhydrocortisone，1-10μm?a83-01，1-10μm?nicotinamide，5-30ml/l?n-2supplement，5-30ml/l?b-27supplement，1-3mm?n-acetylcysteine，0.1-2μm?adezmapimod，5-100ng/mlegf，10-200ng/ml?fgf-10，50-200ng/ml?noggin，50-250ng/ml?r-spondin1，20-200ng/mlheregulin-β-1，50-500ng/ml?wnt3a，2-20μm?forskolin，5-20μm?y-27632，0.5-3％青霉素-鏈霉素-兩性霉素b，余量為advaced?dmem/f12。
6、本專利技術優(yōu)選的，還包括樣本清洗液，所述清洗液各組分濃度如下：0.5-3％青霉素-鏈霉素-兩性霉素b，0.05-0.5mg/ml?dnaseⅰ，1-5mg/ml?dispase?ii，5-20μm?y-27632，余量為1×dpbs。
7、本專利技術優(yōu)選的，所述樣本保存液各組分如下：1-20μm?necrostatin-1，15-40mmglutamax，0.5-3％青霉素-鏈霉素-兩性霉素b，余量為advanced?dmem/f12。
8、本專利技術優(yōu)選的，所述樣本培養(yǎng)基各組分如下：1mm?sodium?pyruvate，10-25mmhepes，20-30mm?glutamax，100-200μg/ml?primocin，10-20nm?17-βestradiol，500ng/mlhydrocortisone，3-5μm?a83-01，5μm?nicotinamide，10ml/l?n-2supplement，20ml/l?b-27supplement，1.25mm?n-acetylcysteine，0.5-1μm?adezmapimod，20ng/ml?egf，100～200ng/ml?fgf-10，100-200ng/ml?noggin，50-250ng/ml?r-spondin1，50ng/ml?heregulin-β-1，100ng/ml?wnt3a，5-10μm?forskolin，10μm?y-27632，1％青霉素-鏈霉素-兩性霉素b，余量為advaced?dmem/f12。
9、2、利用所述的組合物構建類器官的方法，具體方法如下：
10、(1)取卵巢癌穿刺活檢樣本離體后，用清洗液清洗樣本后，用保存液保存；
11、(2)將保存樣本用臺盼藍染色液染色，切除已被染色的非活細胞組織，未被染色的穿刺樣本轉(zhuǎn)移樣本清洗液中，搖晃清洗，期間更換清洗液，同時收集清洗液；
12、(3)將收集的清洗液進行離心，收集管底沉淀；
13、(4)清洗結束，離心收集疏松柔軟的腫瘤樣本，與步驟(3)得到的沉淀過100μm濾網(wǎng)；
14、(5)離心棄去上清，收集樣本沉淀，加入所述樣本培養(yǎng)基，形成細胞懸液后與matrigel充分混勻，滴入孔板；靜置培養(yǎng)讓基質(zhì)膠充分凝固，然后再加入所述樣本培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后，然后加入不含y-27632的樣本培養(yǎng)基，每3天換液一次，培養(yǎng)至卵巢癌類器官形成。
15、本專利技術優(yōu)選的，步驟(1)為穿刺活檢樣本離體后，使用5倍樣本體積的清洗液清洗樣本，隨之轉(zhuǎn)移至10倍樣本體積的樣本保存液中，0-8℃冷鏈運輸。
16、本專利技術優(yōu)選的，步驟(2)中，所述臺盼藍染色液的濃度為0.4％，染色時間為1min。
17、本專利技術優(yōu)選的，步驟(2)中，所述搖晃清洗為25℃，200rpm，60-90min，每5min更換一次樣本清洗液。
18、本專利技術優(yōu)選的，步驟(4)和步驟(5)中，所述離心為500本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術保護點】
1.基于卵巢癌臨床穿刺樣本構建類器官的組合物，其特征在于：所述組合物包括樣本保存液和樣本培養(yǎng)基；
2.根據(jù)權利要求1所述基于卵巢癌臨床穿刺樣本構建類器官的組合物，其特征在于：還包括樣本清洗液，所述清洗液各組分濃度如下：0.5-3％青霉素-鏈霉素-兩性霉素B，0.05-0.5mg/mL?DNaseⅠ，1-5mg/mL?Dispase?II，5-20μM?Y-27632，余量為1×DPBS。
3.根據(jù)權利要求1所述基于卵巢癌臨床穿刺樣本構建類器官的組合物，其特征在于：所述樣本保存液各組分如下：1-20μM?Necrostatin-1，15-40mM?GlutaMAX，0.5-3％青霉素-鏈霉素-兩性霉素B，余量為Advanced?DMEM/F12。
4.根據(jù)權利要求1所述基于卵巢癌臨床穿刺樣本構建類器官的組合物，其特征在于：所述樣本培養(yǎng)基各組分如下：1mM?Sodium?Pyruvate，10-25mM?HEPES，20-30mM?GlutaMAX，100-200μg/mL?Primocin，10-20nM?17-βestradiol，500ng/
5.利用權利要求1～4任一項所述的組合物構建類器官的方法，其特征在于,具體方法如下：
6.根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于：步驟(1)為穿刺活檢樣本離體后，使用5倍樣本體積的清洗液清洗樣本，隨之轉(zhuǎn)移至10倍樣本體積的樣本保存液中，0-8℃冷鏈運輸。
7.根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于：步驟(2)中，所述臺盼藍染色液的濃度為0.4％，染色時間為1min。
8.根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于：步驟(2)中，所述搖晃清洗為25℃，200rpm，60-90min，每5min更換一次樣本清洗液。
9.根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于：步驟(4)和步驟(5)中，所述離心為500×g，4℃，10min。
...【技術特征摘要】
1.基于卵巢癌臨床穿刺樣本構建類器官的組合物，其特征在于：所述組合物包括樣本保存液和樣本培養(yǎng)基；
2.根據(jù)權利要求1所述基于卵巢癌臨床穿刺樣本構建類器官的組合物，其特征在于：還包括樣本清洗液，所述清洗液各組分濃度如下：0.5-3％青霉素-鏈霉素-兩性霉素b，0.05-0.5mg/ml?dnaseⅰ，1-5mg/ml?dispase?ii，5-20μm?y-27632，余量為1×dpbs。
3.根據(jù)權利要求1所述基于卵巢癌臨床穿刺樣本構建類器官的組合物，其特征在于：所述樣本保存液各組分如下：1-20μm?necrostatin-1，15-40mm?glutamax，0.5-3％青霉素-鏈霉素-兩性霉素b，余量為advanced?dmem/f12。
4.根據(jù)權利要求1所述基于卵巢癌臨床穿刺樣本構建類器官的組合物，其特征在于：所述樣本培養(yǎng)基各組分如下：1mm?sodium?pyruvate，10-25mm?hepes，20-30mm?glutamax，100-200μg/ml?primocin，10-20nm?17-βestradiol，500ng/ml?hydrocortisone，3-5μma83-01，5μm?nicotinamide，10ml/l?n-2supplement，20ml/l?b-...
【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：劉海洋，于升，蘇芮，闞方明，米小容，何曉燕，黃璘，
申請(專利權)人：北京嘉士騰醫(yī)學檢驗實驗室有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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