【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于生物藥物，具體涉及一種肝靶向小核酸藥物載體、藥用組合物及其制備方法和應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、肝細胞癌(hepatocellular?carcinoma，hcc)是原發(fā)性肝癌的主要形式，其治愈難度極大，是全球第二大致死性癌癥。手術(shù)切除和化療是hcc常用的治療方式，但手術(shù)切除只適合早期hcc患者，且術(shù)后很容易復(fù)發(fā)。索拉菲尼是一線的小分子化療藥物，但大約2/3患者對索拉菲尼表現(xiàn)出明顯的耐藥性，而且毒副作用很大。因此，合理地根據(jù)腫瘤的基因組學和表觀遺傳學特征進行基因治療，將是治療hcc的關(guān)鍵。
2、近年來，小干擾rna(small?interfering?rna，sirna)、微小rna(microrna,mirna)、反義寡核苷酸(antisense?oligonucleotides，asos)、小發(fā)夾rna(short?hairpinrna，shrna)等核酸藥物受到了廣泛關(guān)注。與在蛋白層面發(fā)揮藥理作用的傳統(tǒng)小分子化學藥和抗體類藥物不同，核酸藥物高度依賴堿基互補配對原則參與基因轉(zhuǎn)錄和翻譯過程，可以高效特異性地調(diào)控致病靶基因，能在提高療效的同時降低毒副作用，對遺傳疾病、腫瘤、代謝類疾病及罕見病等的治療非常有優(yōu)勢。多種核酸在hcc的治療中表現(xiàn)出巨大的潛力。microrna-199a-3p是一種mirna，可通過調(diào)節(jié)雷帕霉素機械靶標(mtor)和p21活化激酶4(pak4)通路來抑制hcc中腫瘤的生長、遷移、侵襲和新生血管的生成。plk1(polo-likekinase?1)屬于polo樣激酶家族，是一類廣泛存在于
3、雖然這些核酸藥物有望治療hcc，但它們本身不穩(wěn)定，容易被體內(nèi)的核酸酶降解，而且?guī)ж撾姾珊茈y被細胞攝取。目前主要通過藥物遞送載體來解決核酸遞送過程中存在的問題。病毒、脂質(zhì)體、納米粒、膠束等常用的遞送載體都存在一些共性的問題，要么毒性大，要么遞送效率低，而且遞送也缺乏靶向性。偶聯(lián)核酸藥物主要以n-乙酰半乳糖胺(galnac)為載體，也是目前應(yīng)用比較廣泛的肝靶向遞送載體。galnac是一種肝細胞特異性去唾液酸糖蛋白受體(asgpr)的高親和力配體，因此galnac核酸偶聯(lián)物可與肝細胞上的asgpr結(jié)合并被迅速內(nèi)化，從而實現(xiàn)核酸的靶向性入胞。但asgpr受體在正常肝細胞上表達較多，肝癌細胞上的表達相對較少，因此對hcc的治療來說，galnac-核酸偶聯(lián)物需要進一步和具有入胞作用的物質(zhì)偶聯(lián)，提高入胞能力。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、有鑒于此，本專利技術(shù)的目的在于提供一種肝靶向小核酸藥物載體，通過將穿膜肽與n-乙酰半乳糖胺(galnac)載體和小分子核酸藥物偶聯(lián)，大大提高核酸的遞送效率，增強肝靶向小核酸藥物載體的入胞，從而實現(xiàn)肝細胞癌的高效治療。
2、本專利技術(shù)提供了一種肝靶向小核酸藥物載體，包括依次連接的n-乙酰半乳糖胺、用于治療肝細胞癌的小核酸藥物和穿膜肽；
3、所述穿膜肽包括以下至少一種：tp10穿膜肽、irgd多肽、細胞穿透肽tpp和crgd多肽。
4、優(yōu)選的，所述tp10穿膜肽、irgd多肽、細胞穿透肽tpp和crgd多肽的氨基酸序列如seq?id?no：1～seq?id?no：4所示。
5、優(yōu)選的，所述用于治療肝細胞癌的小核酸藥物包括以下至少一種：microrna-199a、靶向plk1基因的sirna、靶向vegf基因的sirna和stat3反義寡核苷酸。
6、優(yōu)選的，所述microrna-199a、靶向plk1基因的sirna、靶向vegf基因的sirna和stat3反義寡核苷酸的核苷酸序列如seq?id?no：5～seq?id?no：11所示。
7、優(yōu)選的，所述用于治療肝細胞癌的小核酸藥物包括具有以下至少一種修飾方式的骨架：2′-氟核苷酸修飾、2′-o-甲基修飾、2′-o-甲氧基乙基修飾、鎖核酸修飾、限制性乙基橋核酸修飾、5′-乙烯基膦酸酯修飾和用硫代磷酸酯鍵取代磷酸二酯鍵修飾。
8、優(yōu)選的，所述用于治療肝細胞癌的小核酸藥物和穿膜肽的連接方式包括通過巰基-馬來酰亞胺共價鍵連接。
9、本專利技術(shù)提供了所述肝靶向小核酸藥物載體的制備方法，包括以下步驟：
10、以n-乙酰半乳糖胺為載體，利用基因合成方法合成用于治療肝細胞癌的小核酸藥物單鏈，得到n-乙酰半乳糖胺-核酸單鏈偶聯(lián)物；
11、將所述n-乙酰半乳糖胺-核酸單鏈偶聯(lián)物和穿膜肽進行巰基-馬來酰亞胺共價鍵連接，得到n-乙酰半乳糖胺-核酸單鏈-穿膜肽偶聯(lián)物；
12、將所述n-乙酰半乳糖胺-核酸單鏈-穿膜肽偶聯(lián)物與用于治療肝細胞癌的小核酸藥物的另一條鏈進行退火雜交，得到肝靶向小核酸藥物載體。
13、優(yōu)選的，所述巰基-馬來酰亞胺共價鍵連接的方法包括利用n-乙酰半乳糖胺-核酸單鏈偶聯(lián)物中核酸單鏈的巰基和修飾有馬來酰亞胺的穿膜肽進行化學反應(yīng)或者將穿膜肽上的巰基與核酸單鏈修飾有馬來酰亞胺的n-乙酰半乳糖胺-核酸單鏈偶聯(lián)物進行化學反應(yīng)；
14、所述n-乙酰半乳糖胺-核酸單鏈偶聯(lián)物和穿膜肽的摩爾比為1：(5～30)；
15、所述化學反應(yīng)的時間為2～24h。
16、本專利技術(shù)提供了一種預(yù)防和/或治療肝細胞癌的藥物，活性成分包括所述肝靶向小核酸藥物載體或所述制備方法制備的肝靶向小核酸藥物載體和藥學上可接受的輔料。
17、本專利技術(shù)提供了所述肝靶向小核酸藥物載體或所述制備方法制備的肝靶向小核酸藥物載體在制備預(yù)防和/或治療肝細胞癌的藥物中的應(yīng)用。
18、本專利技術(shù)提供了一種肝靶向小核酸藥物載體，包括依次連接的n-乙酰半乳糖胺、用于治療肝細胞癌的小核酸藥物和穿膜肽；所述穿膜肽包括以下至少一種：tp10穿膜肽、irgd多肽、細胞穿透肽tpp和crgd多肽。本專利技術(shù)穿膜肽添加有利于促進n-乙酰半乳糖胺-小核酸藥物偶聯(lián)物被細胞內(nèi)吞，提高核酸的遞送效率，從而更好的發(fā)揮抗腫瘤的作用。同時，所述肝靶向小核酸藥物載體具有良好的核酸酶穩(wěn)定性，可以保護核酸不受酶降解。實驗結(jié)果表明，與裸小核酸藥物相比，n-乙酰半乳糖胺作為載體與小核酸藥物的連接能夠提高藥物載體的靶向性，同時連接穿膜肽和n-乙酰半乳糖胺形成的藥物載體，其穿膜效果進一步優(yōu)于裸小核酸藥物和僅n-乙酰半乳糖胺和小核酸藥物載體，靶向目標基因的效率大大提高，同時體內(nèi)小動物成像實驗結(jié)果表明本專利技術(shù)制備的肝靶向小核酸藥物載體具有良好的肝靶向性。
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1.一種肝靶向小核酸藥物載體，其特征在于，包括依次連接的N-乙酰半乳糖胺、用于治療肝細胞癌的小核酸藥物和穿膜肽；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述肝靶向小核酸藥物載體，其特征在于，所述TP10穿膜肽、iRGD多肽、細胞穿透肽TPP和cRGD多肽的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：1～SEQ?ID?NO：4所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述肝靶向小核酸藥物載體，其特征在于，所述用于治療肝細胞癌的小核酸藥物包括以下至少一種：microRNA-199a、靶向PLK1基因的siRNA、靶向VEGF基因的siRNA和STAT3反義寡核苷酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述肝靶向小核酸藥物載體，其特征在于，所述microRNA-199a、靶向PLK1基因的siRNA、靶向VEGF基因的siRNA和STAT3反義寡核苷酸的核苷酸序列如SEQ?IDNO：5～SEQ?ID?NO：11所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、3和4中任意一項所述肝靶向小核酸藥物載體，其特征在于，所述用于治療肝細胞癌的小核酸藥物包括具有以下至少一種修飾方式的骨架：2′-氟核苷酸修飾、2′-O-甲基修飾、2′
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述肝靶向小核酸藥物載體，其特征在于，所述用于治療肝細胞癌的小核酸藥物和穿膜肽的連接方式包括通過巰基-馬來酰亞胺共價鍵連接。
7.權(quán)利要求1～6中任意一項所述肝靶向小核酸藥物載體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述制備方法，其特征在于，所述巰基-馬來酰亞胺共價鍵連接的方法包括利用N-乙酰半乳糖胺-核酸單鏈偶聯(lián)物中核酸單鏈的巰基和修飾有馬來酰亞胺的穿膜肽進行化學反應(yīng)或者將穿膜肽上的巰基與核酸單鏈修飾有馬來酰亞胺的N-乙酰半乳糖胺-核酸單鏈偶聯(lián)物進行化學反應(yīng)；
9.一種預(yù)防和/或治療肝細胞癌的藥物，其特征在于，活性成分包括權(quán)利要求1～6中任意一項所述肝靶向小核酸藥物載體或權(quán)利要求7或8所述制備方法制備的肝靶向小核酸藥物載體和藥學上可接受的輔料。
10.權(quán)利要求1～6中任意一項所述肝靶向小核酸藥物載體或權(quán)利要求7或8所述制備方法制備的肝靶向小核酸藥物載體在制備預(yù)防和/或治療肝細胞癌的藥物中的應(yīng)用。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種肝靶向小核酸藥物載體，其特征在于，包括依次連接的n-乙酰半乳糖胺、用于治療肝細胞癌的小核酸藥物和穿膜肽；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述肝靶向小核酸藥物載體，其特征在于，所述tp10穿膜肽、irgd多肽、細胞穿透肽tpp和crgd多肽的氨基酸序列如seq?id?no：1～seq?id?no：4所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述肝靶向小核酸藥物載體，其特征在于，所述用于治療肝細胞癌的小核酸藥物包括以下至少一種：microrna-199a、靶向plk1基因的sirna、靶向vegf基因的sirna和stat3反義寡核苷酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述肝靶向小核酸藥物載體，其特征在于，所述microrna-199a、靶向plk1基因的sirna、靶向vegf基因的sirna和stat3反義寡核苷酸的核苷酸序列如seq?idno：5～seq?id?no：11所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、3和4中任意一項所述肝靶向小核酸藥物載體，其特征在于，所述用于治療肝細胞癌的小核酸藥物包括具有以下至少一種修飾方式的骨架：2′-氟核苷酸修飾、2′-o-甲基修飾、2′-o-甲氧基乙...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：張岱州，楊雪華，李大偉，薛松，孫淑萌，劉正平，毛楷凡，莊婕，樊志萍，
申請(專利權(quán))人：山東省藥學科學院，
類型：發(fā)明
國別省市：
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