【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于生物合成，具體地說(shuō)，涉及一種人工轉(zhuǎn)氨酶及其在制備西他列汀中的應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、腸促胰島激素包括胰高糖素樣多肽-1(glp-1)和葡萄糖依賴性促胰島素分泌多肽(gip)，參與人體內(nèi)葡萄糖內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)生理學(xué)調(diào)控。當(dāng)血糖濃度正常或升高時(shí)，glp-1和gip可通過(guò)涉及環(huán)磷腺苷的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)途徑增加胰腺β細(xì)胞合成并釋放胰島素。西格列汀(化合物ii)化學(xué)名稱為7-[(3r)-3-氨基-1-氧代-4-(2,4,5-三氟苯基)丁基]-5,6,7,8-四氫-3-三氟甲基-1,2,4-三唑并[4,3-a]吡嗪，能夠防止dpp-4水解腸促胰島激素，從而增加活性形式的glp-1和gip的血漿濃度，進(jìn)而改善2型糖尿病患者的血糖控制，具有安全性好、不良反應(yīng)發(fā)生率低等優(yōu)勢(shì)。
2、利用轉(zhuǎn)氨酶生物催化劑是目前工業(yè)上合成西格列汀的主要方式，具有底物轉(zhuǎn)化率高、立體選擇性高、路線簡(jiǎn)潔等優(yōu)點(diǎn)。該工藝中的關(guān)鍵因素--生物催化劑的酶活力或其他性質(zhì)的改進(jìn)一直是制藥領(lǐng)域的研究開(kāi)發(fā)熱點(diǎn)。
3、公布號(hào)為cn102405281b的專利文獻(xiàn)公開(kāi)了在arthrobacter?sp.來(lái)源(r)-ω-轉(zhuǎn)氨酶基礎(chǔ)上，利用氨基酸位點(diǎn)組合突變、蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)、定點(diǎn)飽和突變、全基因序列隨機(jī)突變等方法，獲得的轉(zhuǎn)氨酶突變體能夠在50％水相-50％?dmso有機(jī)相中高效催化(2z)-4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氫-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8h)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮(化合物i，cas號(hào)7646
4、
5、近年來(lái)，我們也陸續(xù)在公布號(hào)為cn112094856b、cn115873816a、cn116240189a以及wo2024/098269a1的專利文件中分別報(bào)道了費(fèi)希新薩托菌(neosartorya?fischeri)和節(jié)桿菌(arthrobacter?sp.knk168)來(lái)源的轉(zhuǎn)氨酶或其突變體催化化合物i(cas號(hào)764667-65-4)進(jìn)行選擇性氨基化反應(yīng)制備西格列汀的研究進(jìn)展。
6、上述酶法工藝過(guò)程具有產(chǎn)品得率高、生產(chǎn)效率高等優(yōu)點(diǎn)。但是，反應(yīng)體系中若使用dmso作為有機(jī)助溶劑時(shí)，價(jià)格昂貴，而且后處理復(fù)雜，導(dǎo)致生產(chǎn)成本增加。甲醇對(duì)于底物和產(chǎn)物的溶解性也較好，相對(duì)而言，甲醇價(jià)格低廉，且作為助溶劑更易于反應(yīng)后處理，因此利用甲醇作為替代溶劑能夠降低西他列汀的生產(chǎn)成本。但是，arthrobacter?sp.(r)-ω-轉(zhuǎn)氨酶酶源單一，且相關(guān)突變體序列和突變位點(diǎn)受到不少專利保護(hù)，因此亟需開(kāi)發(fā)新型轉(zhuǎn)氨酶適用甲醇助溶的反應(yīng)體系。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、新型轉(zhuǎn)氨酶理想地應(yīng)當(dāng)滿足幾個(gè)要求：一是催化化合物i進(jìn)行酮基轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)時(shí)具有位置選擇性，即兩個(gè)酮基中僅選擇3-位酮基但對(duì)2-位酮基無(wú)作用；二是立體選擇性/空間結(jié)構(gòu)選擇性高，即僅將3-位酮基轉(zhuǎn)變?yōu)閞-構(gòu)型氨基但不會(huì)消旋化、且不會(huì)僅轉(zhuǎn)變?yōu)閟-構(gòu)型；三是酶活性中心的口袋-通道結(jié)構(gòu)在高濃度有機(jī)溶劑醇類例如甲醇/dmso水溶液環(huán)境中保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性；四是酶比活高；五是無(wú)底物和產(chǎn)物抑制性或抑制性很低。為尋求這樣的轉(zhuǎn)氨酶，我們與中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所合作，基于現(xiàn)有技術(shù)已報(bào)道可用于催化化合物i合成西格列汀(ii)的(r)-ω-轉(zhuǎn)氨酶的氨基酸序列和結(jié)構(gòu)模型，經(jīng)計(jì)算機(jī)模擬計(jì)算進(jìn)行建模，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，篩選到一株人工合成的轉(zhuǎn)氨酶，其模型參見(jiàn)圖1，氨基酸序列為seq?id?no:1，命名為at0。然后，在at0的基礎(chǔ)上，我們還嘗試對(duì)at0做進(jìn)一步突變改造，篩選出一些酶活力明顯提高的突變體，包括氨基酸序列為seq?id?no:3的突變酶，命名為at16。具體地，本專利技術(shù)包含如下技術(shù)方案：
2、本專利技術(shù)的第一個(gè)方面提供了一種用于催化化合物i即cas號(hào)764667-65-4反應(yīng)制備西格列汀即化合物ii的轉(zhuǎn)氨酶，其為選自下述的多肽：
3、(a)氨基酸序列為seq?id?no:1的多肽，本文中命名為at0；
4、(b)將氨基酸序列seq?id?no:1經(jīng)過(guò)一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的保守性變異多肽；或
5、(c)與(a)限定的多肽序列有90％以上同源性、優(yōu)選地92％以上同源性、優(yōu)選地95％以上同源性、優(yōu)選地97％以上同源性、優(yōu)選地98％以上同源性、更優(yōu)地99％以上同源性、且在甲醇溶液反應(yīng)體系中的酶活力相比seq?id?no:1提高的多肽。
6、mdiginsdpmatmdkvfagyaarqkameaagnplsegiawvegemvplhearipmldegfmrsdltydvpsvwdgrffrlddhlsrleascaklrlklplpreevkkilvemvaksgirdafveiivtrglkgvrgsrpeeivnrlymlvqpyvwvmepevqpvggdaviartvrrvppgsidptvknlqwgdfvrglfeasdrgatypfltdgdanltegsgfnivlvkdgvlytpdrgvlqgvtrksvidvanakgfevrveyvpveaayhadeifmcttaggimpirsldgkpvndgkvgpitgywglinhpelitpve(seq?id?no:1)。
7、上述酶活力是指催化化合物cas號(hào)764667-65-4即(2z)-4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氫-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8h)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮發(fā)生選擇性氨基化反應(yīng)(3-位酮基轉(zhuǎn)變?yōu)閞型手性氨基的轉(zhuǎn)氨基反應(yīng))制備西格列汀的酶活力。
8、優(yōu)選地，上述轉(zhuǎn)氨酶為氨基酸序列為seq?id?no:3的多肽，本文中命名為at16。
9、mdiginsdpmatmdkafagyaarqkameaagnprsegiawvegemvplhearipmldegfmrsdltydvpsvwdgrffrldahlsrleascaklrlklplprvevkkilvemvdksgirdafveiivtrglkgvrgsrpeeivnrlymlvqpyvwlmepevqpvggdaviartvrrvppgsidptvknlqwgdfvrglfegsdrgatypfltdgdanltegsgfnialvkdgvlytpdrgvlqgmtrksvidvanakgfevrveyvpveadyhadeifmcttaggimptrsldgkpvndgkvgpitgywglinhpelitpve(seq?id?no:3)。
10、轉(zhuǎn)氨酶at16是at0的第16位的纈氨酸突變?yōu)楸彼?v16a)、第34位的亮氨酸突變?yōu)榫彼?l34r)、第82位的天冬氨酸突變?yōu)楸彼?d82a)、第103位的谷氨酸突變?yōu)槔i氨酸(e103v)、第114位的丙氨酸突變?yōu)樘於彼?a114d)、第156位的纈氨酸突變?yōu)榱涟彼?v156l)、第2本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種用于催化化合物CAS號(hào)764667-65-4反應(yīng)制備西格列汀的轉(zhuǎn)氨酶，其為選自下述的多肽：
2.如權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)氨酶，其特征在于，所述轉(zhuǎn)氨酶為氨基酸序列為SEQ?ID?NO:3的多肽。
3.編碼如權(quán)利要求1或2所述轉(zhuǎn)氨酶的基因。
4.如權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于，氨基酸序列如SEQ?ID?NO:1所示的轉(zhuǎn)氨酶的編碼基因的核苷酸序列為SEQ?ID?NO:2，或者是與SEQ?ID?NO:2有90％以上同源性的核苷酸序列；
5.一種DNA分子，其特征在于，包含如權(quán)利要求4所述的轉(zhuǎn)氨酶的編碼基因例如核苷酸序列SEQ?ID?NO:2或SEQ?ID?NO:4。
6.一種重組質(zhì)粒，其特征在于，包含如權(quán)利要求5所述的DNA分子。
7.一種用于表達(dá)如權(quán)利要求1所述轉(zhuǎn)氨酶的微生物工程菌，其特征在于，基因組中整合了如權(quán)利要求4所述的基因，或者是轉(zhuǎn)化了如權(quán)利要求6所述重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子。
8.如權(quán)利要求7所述的微生物工程菌，其特征在于，所述微生物是大腸桿菌。
9.如權(quán)利要求1所述轉(zhuǎn)氨酶或者如權(quán)
10.如權(quán)利要求9所述的用途，其特征在于，在含有甲醇作為助溶劑的反應(yīng)體系中，以化合物CAS號(hào)764667-65-4即(2Z)-4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氫-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮為反應(yīng)底物，采用如權(quán)利要求1所述轉(zhuǎn)氨酶或者如權(quán)利要求7所述微生物工程菌催化氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，得到西格列汀。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種用于催化化合物cas號(hào)764667-65-4反應(yīng)制備西格列汀的轉(zhuǎn)氨酶，其為選自下述的多肽：
2.如權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)氨酶，其特征在于，所述轉(zhuǎn)氨酶為氨基酸序列為seq?id?no:3的多肽。
3.編碼如權(quán)利要求1或2所述轉(zhuǎn)氨酶的基因。
4.如權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于，氨基酸序列如seq?id?no:1所示的轉(zhuǎn)氨酶的編碼基因的核苷酸序列為seq?id?no:2，或者是與seq?id?no:2有90％以上同源性的核苷酸序列；
5.一種dna分子，其特征在于，包含如權(quán)利要求4所述的轉(zhuǎn)氨酶的編碼基因例如核苷酸序列seq?id?no:2或seq?id?no:4。
6.一種重組質(zhì)粒，其特征在于，包含如權(quán)利要求5所述的dna分子。
7....
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：王金剛，韋炎龍，步緒亮，任亮，梁巖，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：上海邦林生物科技有限公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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