【技術實現步驟摘要】
本申請涉及微生物基因工程，尤其是涉及一種以3-巖藻糖基乳糖為前體合成巖藻糖的工程菌及其構建方法和應用。
技術介紹
1、巖藻糖(fucose，fuc)是一種廣泛存在的天然糖，亦稱6-脫氧-半乳糖，l-巖藻糖是構成母乳低聚糖的五種單糖之一，廣泛存在于動物、植物、藻類中，發揮重要的生理功能。l-巖藻糖具有調節腸道健康、增強機體抵抗力、延緩皮膚衰老等功效。fuc的商業化生產主要包括海藻酸水解提取巖藻多糖再純化、化學方法以己糖為原料轉化和酶水解產巖藻糖的細菌的胞外多糖等方法，這些l-巖藻糖生產方法存在經濟效益低，對環境不友好，應用場景有限等問題，因而專利技術新的l-巖藻糖生產方法具有潛在的應用價值。生物合成法僅需以廉價的碳源和細胞內可再生供體為原料，且以較低的環境代價獲得高經濟產出，因此具有更為廣闊的應用前景。然而，fuc的微生物合成產量仍然較低，并且合成路徑單一，無法突破產量瓶頸。因此亟需開發一種新的合成路徑以提高fuc的產量。
技術實現思路
1、本申請的目的在于克服上述現有技術的不足之處而提供一種能夠利用3-巖藻糖基乳糖合成巖藻糖的工程菌及其構建方法和應用。
2、為實現上述目的，本申請采取的技術方案為：
3、第一方面，本申請提供了一種以3-巖藻糖基乳糖為前體合成巖藻糖的工程菌，所述工程菌表達α-1,3-巖藻糖基轉移酶和α-l-巖藻糖苷酶。
4、本申請首先是通過異源表達獲得不同來源的α-l-巖藻糖苷酶以篩選得到具有催化3-fl轉化為fuc活性的α-l-巖
5、作為本申請所述工程菌的優選實施方式，所述α-l-巖藻糖苷酶為α-l-巖藻糖苷酶afca或α-l-巖藻糖苷酶afcb。為了確認α-l-巖藻糖苷酶的3-fl催化活性，專利技術人通過制備不同來源的α-l-巖藻糖苷酶進行3-fl催化實驗，篩選得到了具有催化3-fl為fuc的α-l-巖藻糖苷酶afca(來源于雙歧桿菌屬bifidobacterium)和afcb(來源于兩岐雙岐桿菌bifidobacterium?bifidum?jcm?1254)，使得制備得到的工程菌具有將3-fl轉化為fuc的活性，實現fuc在工程菌體內生物全合成。
6、作為本申請所述工程菌的優選實施方式，所述α-1,3-巖藻糖基轉移酶的氨基酸序列如seq?id?no.1所示；
7、所述α-l-巖藻糖苷酶afca的氨基酸序列如seq?id?no.3所示；
8、所述α-l-巖藻糖苷酶afcb的氨基酸序列如seq?id?no.4所示。
9、作為本申請所述工程菌的優選實施方式，所述工程菌還表達bcgw基因簇，敲除糖轉運蛋白。
10、作為本申請所述工程菌的優選實施方式，所述bcgw基因簇為整合磷酸甘露糖突變酶manb、甘露糖-1-磷酸鳥苷轉移酶manc、gdp-d-甘露糖-4,6-脫水酶gmd和gdp-l-巖藻糖合成酶wcag的基因簇，所述bcgw基因簇的氨基酸序列如seq?id?no.2所示。
11、本申請以果糖-6-磷酸為底物在基因mana、manb、manc、gmd和wcag作用下合成gdp-l-巖藻糖，胞外乳糖被β-半乳糖苷通透酶lacy轉運至胞內，然后在α-1，3-巖藻糖基轉移酶作用下和gdp-l-巖藻糖合成3-fl，3-fl在α-l-巖藻糖苷酶的作用下分解為巖藻糖，實現巖藻糖的全合成。
12、作為本申請所述工程菌的優選實施方式，所述糖轉運蛋白包括多藥外排系統蛋白mdfa、mfs轉運蛋白mdtd和外膜孔蛋白c?ompc中的至少一種。
13、本申請在實驗的過程中發現具有催化3-fl活性的α-l-巖藻糖苷酶的催化效率不夠理想，為了提高催化效率，從提高底物濃度入手，通過查找并逐個敲除大腸桿菌bl21的內源糖轉運蛋白以篩選得到與3-fl轉運相關的糖轉運蛋白，結果發現糖轉運蛋白中的mdfa、mdtd和ompc與3-fl轉運至胞外的效率密切相關，且當mdfa、mdtd和/或ompc被敲除時，3-fl的胞外濃度大幅下降(可從7.6g/l降至0.3g/l)，由此將mdfa、mdtd和/或ompc敲除，使得工程菌胞內的3-fl濃度提高，進而實現fuc產量的提高。
14、作為本申請所述工程菌的優選實施，所述多藥外排系統蛋白mdfa的氨基酸序列如seq?id?no.5所示；
15、所述mfs轉運蛋白mdtd的氨基酸序列如seq?id?no.6所示；
16、所述外膜孔蛋白c?ompc的氨基酸序列如seq?id?no.7所示。
17、作為本申請所述工程菌的優選實施方式，所述工程菌還敲除β-半乳糖苷酶lacz、巖藻糖異構酶/墨角藻糖激酶基因簇fucik和磷酸十一碳基葡萄糖磷酸轉移酶wcaj基因；
18、所述β-半乳糖苷酶lacz的氨基酸序列如seq?id?no.8所示；
19、所述巖藻糖異構酶/墨角藻糖激酶基因簇fucik的氨基酸序列如seq?id?no.9所示；
20、所述磷酸十一碳基葡萄糖磷酸轉移酶wcaj的氨基酸序列如seq?id?no.10所示。
21、本申請通過在工程菌中整合了bcgw基因簇、α-1,3-巖藻糖基轉移酶，同時敲除了β-半乳糖苷酶lacz、巖藻糖異構酶/墨角藻糖激酶基因簇fucik和磷酸十一碳基葡萄糖磷酸轉移酶wcaj基因，構建了3-fl的生物合成通路，為fuc的合成提供前體。
22、第二方面，本申請提供了上述工程菌的構建方法，包括以下步驟：
23、s1、利用cripsr-cas9技術將大腸桿菌bl21(de3)中的β-半乳糖苷酶lacz、巖藻糖異構酶/墨角藻糖激酶基因簇fucik和磷酸十一碳基葡萄糖磷酸轉移酶wcaj基因敲除，得到大腸桿菌ⅰ；
24、s2、利用酶切連接法將帶有α-1,3-巖藻糖基轉移酶、α-l-巖藻糖苷酶、bcgw基因簇的載體整合至步驟s1所得大腸桿菌ⅰ中，得到大腸桿菌ⅱ；
25、s3、利用cripsr-cas9技術敲除步驟s2所得大腸桿菌ⅱ中的糖轉運蛋白，得到以3-巖藻糖基乳糖為前體合成巖藻糖的工程菌。
26、第三方面，本申請提供了上述工程菌在生產巖藻糖中的應用。
27、第四方面，本申請提供了一種巖藻糖的生產方法，主要由上述工程菌通過補料分批發酵得到。
28、與現有技術相比，本申請具有以下有益效果：
29、1、本申請通過在大腸桿菌中整合了bcgw基因簇、α-1,3-巖藻糖基轉移酶和具有催化3-fl活性的α-l-巖藻糖苷酶，同時敲除了β-半乳糖苷酶lacz、巖藻糖異構酶/墨角藻糖激酶基因簇fucik和磷酸十一碳基葡萄糖磷酸轉移酶wcaj基因，構建了fuc的胞內生物全合成通路，為fuc生物合成開辟了一條新的生物合成通路。
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1.一種以3-巖藻糖基乳糖為前體合成巖藻糖的工程菌，其特征在于，所述工程菌表達α-1,3-巖藻糖基轉移酶和α-L-巖藻糖苷酶。
2.如權利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述α-L-巖藻糖苷酶為α-L-巖藻糖苷酶AfcA或α-L-巖藻糖苷酶AfcB。
3.如權利要求1或2所述的工程菌，其特征在于，所述α-1,3-巖藻糖基轉移酶的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示；
4.如權利要求1-3任一項所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌還表達BCGW基因簇，敲除糖轉運蛋白。
5.如權利要求4所述的工程菌，其特征在于，所述BCGW基因簇為整合磷酸甘露糖突變酶manB、甘露糖1-1磷酸鳥苷轉移酶manC、GDP-D-甘露糖-4,6-脫水酶gmd和GDP-L-巖藻糖合成酶wcaG的基因簇，所述BCGW基因簇的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。
6.如權利要求4所述的工程菌，其特征在于，所述糖轉運蛋白包括多藥外排系統蛋白MdfA、MFS轉運蛋白MdtD和外膜孔蛋白C?OmpC中的至少一種。
7.如權利要求6所述的工程
8.如權利要求1-7任一項所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌還敲除β-半乳糖苷酶lacZ、巖藻糖異構酶/墨角藻糖激酶基因簇fucIK和磷酸十一碳基葡萄糖磷酸轉移酶wcaj基因；
9.如權利要求1-8任一項所述工程菌的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：
10.如權利要求1-8任一項所述的工程菌在生產巖藻糖中的應用。
...【技術特征摘要】
1.一種以3-巖藻糖基乳糖為前體合成巖藻糖的工程菌，其特征在于，所述工程菌表達α-1,3-巖藻糖基轉移酶和α-l-巖藻糖苷酶。
2.如權利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述α-l-巖藻糖苷酶為α-l-巖藻糖苷酶afca或α-l-巖藻糖苷酶afcb。
3.如權利要求1或2所述的工程菌，其特征在于，所述α-1,3-巖藻糖基轉移酶的氨基酸序列如seq?id?no.1所示；
4.如權利要求1-3任一項所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌還表達bcgw基因簇，敲除糖轉運蛋白。
5.如權利要求4所述的工程菌，其特征在于，所述bcgw基因簇為整合磷酸甘露糖突變酶manb、甘露糖1-1磷酸鳥苷轉移酶manc、gdp-d-甘露糖-4,6-脫水酶gmd和gdp-l-巖藻糖合成酶w...
【專利技術屬性】
技術研發人員：夏沁怡，勞才文，金憶文，沈慧敏，李賀，樊希杰，張啟宏，
申請(專利權)人：合肥中科健康生物產業技術研究院有限公司，
類型：發明
國別省市：
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