本發明專利技術公開了一種基于MALDI?TOFMS檢測MGIT?960液體培養基的鑒定方法，選取60例960分桿菌快速液體培養系統報陽的標本并進行試驗操作；通過在液體培養報陽后繼續培養，并分時段檢測從而確定最佳檢測時間，即液體培養菌種濁度，同時選用不同直徑磁珠和破壁方法，來確定最佳獲得菌體的核糖體蛋白操作，通過與傳統方案的鑒定結果比較960液體培養MALDI?TO0F?MS鑒定方法的正確度，記錄不同處理方法的檢出率，以此尋找最佳處理方案，并對整體方案進行分析評估，以確立最優處理方法，達到提高檢出率的目標。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及液體培養基鑒定，尤其涉及一種基于maldi-tofms檢測mgit?960液體培養基的鑒定方法。
技術介紹
1、基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(maldi-tof-ms)是一種全新的微生物快速檢測和鑒定技術，對細菌的快速、準確和實時鑒定具有重要意義。但分枝桿菌細胞璧堅韌、脂質含量高，因此生長緩慢、
2、不易裂解獲得足量蛋白質，使maldi-tofms鑒定面臨諸多困難。應用maldi-tofms檢測分枝桿菌鑒定國內外雖有相關研究報道，但前處理方法多局限固體培養，saleeb等首次將maldi-tofms應用于固體培養物鑒定，利用其自行設計的前處理方法，鑒定至種(或復合群)的準確率可達100%。但僅限于固體培養。而液體培養物鑒定，由于樣本以及液體介質的潛在干擾，陽性菌量數較低等因素,從液體培養基中準確的鑒定分枝桿菌還是較為困難。balada-llasat等于2013年首次對mgit液體培養陽性標本的maldi-tofms直接鑒定進行了系統評價，其前處理方法在蛋白質提取、純化前進行了集菌及洗滌等步驟，結果顯示液體培養直接鑒定的準確率可與固體培養相媲美，然而其中仍存在鑒定失敗的情況。
3、應用maldi-tof?ms鑒定液體培養物鑒定的難點主要有以下幾點:
4、(一)如何獲得足夠的鑒定菌量，自動檢測系統設計的靈敏度是盡可能快地檢測分枝桿菌的生長。因此，陽性液體樣品含有較少的菌量，將液體培基報陽后繼續孵育以獲得足夠的鑒定菌量，那么報陽后液體樣品繼續培養幾天，培養濃度達到多少。
>5、(二)去除液體培基成分對菌體蛋白的影響，mcit?960?液體培養基的主要成分是熒光指示劑(固定在管底)和培養液，如直接將報陽的液體培養基進行加熱滅活，培養基中的蛋白質成分可能會干擾菌體蛋白的提取,多篇文獻均提到經過離心處理后取沉淀來去除液體培基可能對菌體蛋白的影響。6、(三)獲得菌體的核糖體蛋白，分枝桿菌細胞壁堅韌、脂質含量高，要想提取分枝桿菌的核糖體蛋白必須充分破壞其細胞壁，文獻提供的方法一般是增加微型玻璃珠機械研磨及超聲震蕩等物理裂解法，以促進細胞壁堅韌的分枝桿菌屬菌體裂解。但珠子直徑大小，震蕩時間方式文獻各有不同。
7、綜上所述，本課題意在通過探索不同的實驗條件，即在液體培養報陽后繼續培養，并分時段檢測從而確定最佳檢測時間，即液體培養菌種濁度。同時選用不同直徑磁珠和破壁方法，來確定最佳獲得菌體的核糖體蛋白操作。從而達到提高檢出率的實驗目標。
8、為此提出一種基于maldi-tofms檢測mgit?960液體培養基的鑒定方法，欲通過本方法優化檢測目標物的前處理流程，以達到臨床較滿意檢出率。
技術實現思路
1、本專利技術的目的是為了解決
技術介紹
中提出的現有技術中存在的缺點，而提出的一種基于maldi-tofms檢測mgit?960液體培養基的鑒定方法。
2、為了實現上述目的，本專利技術采用了如下技術方案：
3、一種基于maldi-tofms檢測mgit?960液體培養基的鑒定方法，包括以下步驟：
4、s1、選取60例960分桿菌快速液體培養系統報陽的標本并進行試驗操作；
5、s2、記錄陽性液體培養物濁度，取1.2m1培養液到1.5ml的eppendorf管；
6、s3、將步驟s2中的培養液進行離心處理，并用移液槍小心吸棄上層清液；
7、s4、吸出上層清液后再加入300μl去離子水，置100℃金屬浴30min；
8、s5、樣本冷卻后，加入75%乙醇900μl，充分混勻；
9、s6、將步驟s5中加入乙醇的樣本液體進行再次離心處理，并用移液槍小心吸棄上清液；
10、s7、對s6步驟中吸除上清液的樣本液體進行沉淀，并在沉淀中加入約10μl的氧化皓/硅膠珠，視沉淀多少加入15-30μl的純乙腈；
11、s8、加入與乙腈體積相同的70%甲酸溶液，渦旋震蕩30s后再離心處理；
12、s9、在s8步驟離心處理后取上清1μl滴加到質譜儀靶板上，并在室溫下自然晾干；
13、s10、在上述樣品點上覆蓋1μl的hcca基質溶液，自然晾干后即可上機質譜鑒定；
14、s11、再將原管繼續培養1天、3天，5天，重復以上記錄及操作，分別記錄檢測結果同時將60例培養物進行固體培基轉種，使用傳統方法進行鑒定，運用pnb固體培養、mpb64抗原檢測及基因芯片技術進行分枝桿菌菌種鑒定，并記錄鑒定結果，作為質譜檢測結果的對照，以評估maldi-tof-ms檢測結果的準確性。
15、作為本專利技術方法中進一步的，s3與s5步驟中，離心處理的參數皆為：離心時間為2min，離心轉速13000rpm。
16、作為本專利技術方法中進一步的，s7步驟中，加入的純乙腈要沒過沉淀物。
17、作為本專利技術方法中進一步的，s7步驟中，每例培養物分別采取0.1mm硅膠珠，并通過漩渦震蕩2min:0.1mm硅膠珠，漩渦震蕩2min:0.5mm硅膠珠，超聲破碎2min:0.5mm硅膠珠，超聲破碎2min，四種方式進行處理。
18、作為本專利技術方法中進一步的，s8步驟中，離心處理的參數為：離心轉速13000r/min，離心時間為2min。
19、作為本專利技術方法中進一步的，s11步驟中，s111、當maldi-tof-ms鑒定結果與傳統結果不符時，將待測菌種進行單/多源性基因檢測，確定菌種。
20、s112、結果處理：
21、1)通過與傳統方案的鑒定結果比較960液體培養maldi-to0f-ms鑒定方法的正確度；
22、2)記錄不同處理方法的檢出率，以此尋找最佳處理方案，并對整體方案進行分析評估，以確立最優處理方法。
23、本專利技術的有益效果
24、本申請通過與傳統方案的鑒定結果比較960液體培養maldi-to0f-ms鑒定方法的正確度，并記錄不同處理方法的檢出率，能尋找最佳處理方案，并對整體方案進行分析評估，更好的確立最優處理方法。
25、本申請在液體培養報陽后繼續培養，并分時段檢測從而確定最佳檢測時間，即液體培養菌種濁度，同時選用不同直徑磁珠和破壁方法，來確定最佳獲得菌體的核糖體蛋白操作，從而達到提高檢出率的實驗目標。
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【技術保護點】
1.一種基于MALDI-TOFMS檢測MGIT?960液體培養基的鑒定方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的一種基于MALDI-TOFMS檢測MGIT?960液體培養基的鑒定方法，其特征在于，S3與S5步驟中，離心處理的參數皆為：離心時間為2min，離心轉速13000rpm。
3.根據權利要求1所述的一種基于MALDI-TOFMS檢測MGIT?960液體培養基的鑒定方法，其特征在于，S7步驟中，加入的純乙腈要沒過沉淀物。
4.根據權利要求1所述的一種基于MALDI-TOFMS檢測MGIT?960液體培養基的鑒定方法，其特征在于，S7步驟中，每例培養物分別采取0.1mm硅膠珠，并通過漩渦震蕩2min:0.1mm硅膠珠，漩渦震蕩2min:0.5mm硅膠珠，超聲破碎2min:0.5mm硅膠珠，超聲破碎2min，四種方式進行處理。
5.根據權利要求1所述的一種基于MALDI-TOFMS檢測MGIT?960液體培養基的鑒定方法，其特征在于，S8步驟中，離心處理的參數為：離心轉速13000r/min，離心時間為2min。p>
6.根據權利要求1所述的一種基于MALDI-TOFMS檢測MGIT?960液體培養基的鑒定方法，其特征在于，S11步驟中，S111、當MALDI-TOF-MS鑒定結果與傳統結果不符時，將待測菌種進行單/多源性基因檢測，確定菌種。
7.根據權利要求1所述的一種基于MALDI-TOFMS檢測MGIT?960液體培養基的鑒定方法，其特征在于，S112、結果處理：
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【技術特征摘要】
1.一種基于maldi-tofms檢測mgit?960液體培養基的鑒定方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的一種基于maldi-tofms檢測mgit?960液體培養基的鑒定方法，其特征在于，s3與s5步驟中，離心處理的參數皆為：離心時間為2min，離心轉速13000rpm。
3.根據權利要求1所述的一種基于maldi-tofms檢測mgit?960液體培養基的鑒定方法，其特征在于，s7步驟中，加入的純乙腈要沒過沉淀物。
4.根據權利要求1所述的一種基于maldi-tofms檢測mgit?960液體培養基的鑒定方法，其特征在于，s7步驟中，每例培養物分別采取0.1mm硅膠珠，并通過漩渦震蕩2min:0.1mm硅膠珠，漩渦震蕩...
【專利技術屬性】
技術研發人員：秦中華，徐玲，周崢，王超，張東，
申請(專利權)人：天津市海河醫院，
類型：發明
國別省市：
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