【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及山蘭種子萌發，具體為一種利用脆柄菇屬真菌促進山蘭種子萌發的方法。
技術介紹
1、山蘭為蘭科山蘭屬，四季常綠多年生草本植物，具有極高的觀賞和藥用價值。蘭科植物和真菌形成典型的蘭科菌根，菌根共生關系伴隨著蘭科植物從種子萌發到開花結果的全部生活史。
2、蘭科菌根是蘭科植物的根狀莖（原球莖）或成年植株根部與特定真菌形成的一種共生體，這些特定真菌被定義為蘭科菌根真菌。至今發現的共生真菌種類基本上是擔子菌類和子囊菌類，常見的屬有：膠膜菌屬、絲核菌屬、鐮刀菌屬、角擔菌屬、脆柄菇屬、蠟殼菌屬、曲霉屬等。
3、鑒于山蘭種子在自然環境中萌發高度依賴于特定真菌的共生關系，深入探索并培育能夠顯著促進山蘭這一珍貴蘭科藥用植物種子萌發的優良真菌菌株，特別是脆柄菇屬真菌，顯得尤為迫切與重要。此舉不僅旨在提升山蘭種子的萌發率，還期望能優化其原球莖的形成效率，從而構建起一條通往山蘭種子保育與資源可持續利用的高效路徑，為保護生物多樣性、促進藥用植物資源的合理利用奠定堅實基礎。
技術實現思路
1、本專利技術的目的在于提供一種利用脆柄菇屬真菌促進山蘭種子萌發的方法，以解決上述
技術介紹
中提出的問題。
2、為實現上述目的，本專利技術提供如下技術方案：一種利用脆柄菇屬真菌促進山蘭種子萌發的方法，包括以下步驟：
3、s1：分離和鑒定適合促進山蘭種子萌發的脆柄菇屬真菌菌株
4、選擇生長在長白山區系的野生成年山蘭苗根部，利用徒手切片技術及ch3cooh黑墨染色
5、在超凈臺中，使用高溫滅菌后的刀片和鑷子將吸干水分后的根段切成1mm左右的薄片，將根段薄片平鋪在fim培養基中，于28℃和12h光照條件下培養，待根段薄片周圍長出菌絲時，將單菌落菌絲轉移至fim培養基中繼續培養并不斷純化，直至獲得單菌落菌株；
6、將裝有真菌的2ml?ep管中加入300μl、80mmol/l?tris裂解液、2ml的ctab，高頻震蕩3min，放入80℃水浴鍋中水浴加熱融解10min，目的是盡量的讓真菌細胞壁內的dna釋放至溶液中，將ep管依次加入500μl等體積的氯仿和異戊醇，手動搖晃3min，在8000g的離心機中離心8min，吸取上清液500μl，放冰箱4℃環境中靜置12h，選取沉淀dn用75%酒精洗滌沉淀2次，12000g離心機3min，靜置沉淀物，待其中的酒精完全揮發，取50μl?te緩沖液加入沉淀物中徹底溶解dna，備用；
7、pcr擴增反應體系（50μl）如表1；
8、pcr擴增反應程序如圖1；
9、經過rdna-its分子鑒定，將結果用nbci軟件進行比對分析，參考對比中相似度最高序列真菌類別，將分離的到內生真菌鑒定為脆柄菇屬（psathyrella）真菌，菌根真菌its比對結構如表2。
10、s2：對選定的脆柄菇屬真菌菌株進行形態學觀察和生物學特性測定
11、菌根真菌形態特征觀察，將選定的真菌接種到fim培養基中，當菌絲長至培養基表面2/3時，利用光學顯微鏡觀察菌絲形態特征，從菌絲接入到培養基時間起，每8h在統計分析菌絲的生長速度和變化，同時，對菌落形態進行觀察和統計分析；
12、選取的菌株在接種到培養基后第3天開始迅速生長，在10天后長滿培養基全皿，在7d生長速度最快，平均生長速度為0.56cm/d；真菌的菌落正面布滿規則狀氣生絨毛菌絲并呈白色不透明狀，背面黃白色同心圓結，不產孢子；菌絲平均直徑9.32μm，有隔膜，無直角分支；
13、菌根真菌生物學特性測定，將分離鑒定出的脆柄菇屬psa-2菌株活化后，取0.3*0.3cm真菌瓊脂塊，真菌面朝上，置于含碳（蔗糖、葡萄糖、乳糖、果糖、麥芽糖、無碳源ck）、氮（酵母、牛肉膏、蛋白胨、硫酸銨、硝酸鉀、無氮源ck）、ph（4~8）、溫度（10~35℃，6組處理）的fim培養基條件下培養統計分析真菌的生長發育數據（6組處理、10個重復），在培養皿背面劃線，統計分析菌絲生長速度；
14、脆柄菇屬psa-2菌株生物學特性測定如表3。
15、s3：對山蘭種子進行形態學觀察和不同萌發階段劃定
16、山蘭種子形態學觀察，使用體視顯微鏡和電子學顯微鏡，對山蘭種子進行種子整體形態和微觀結構進行觀察，含有水分的山蘭種子整體呈褐色，干燥狀態下種子呈深棕色，梭形，一頭細長，一頭略圓，胚乳在較粗的一端，長約1000μm，寬約250μm，種皮表面呈網格狀，每個網格內部都有絮狀結構；
17、山蘭種子不同萌發階段的觀察，選取未開裂、飽滿的蒴果洗凈后，流水沖洗24h，于2%次氯酸鈉溶液中浸泡3min，再依次用無菌水沖洗3~5次，在超凈臺中，用鑷子和解剖刀沿隔膜線縱向劃開果皮，輕抖果實將種子均勻播鋪到4.0g/l、8.0g/l、12.0g/l燕麥培養基表面，將脆柄菇屬菌株切割為0.3*0.3cm的真菌瓊脂塊，接種到鋪滿山蘭種子的燕麥培養基中，并用無菌瓊脂塊設置對照組，為排除污染干擾，設置15個重復，接種后每天觀察和統計種子的萌發情況，計算山蘭種子的萌發率和原球莖形成率，并對山蘭種子萌發過程進行觀察統計分析，將山蘭種子萌發的動態過程劃分為5個階段；
18、山蘭種子動態萌發過程如表4。
19、s4：脆柄菇屬真菌促進山蘭種子萌發的條件篩選
20、山蘭種子萌發過程中，種子出現頂端分生組織時到第一片真葉形成之間的狀態稱為原球莖時期，在這之后種子會變成幼苗狀態，再逐漸發育形成植株，在山蘭種子萌發的初期階段，本試驗借助體視顯微鏡對4.0g/l、8.0g/l、12.0g/l燕麥培養基表面的種子生長發育情況進行觀察和統計分析，待共生培養超過2周時，菌絲體會長滿培養基表面，需要定期將多余的菌絲在超凈工作臺中去除；
21、脆柄菇屬菌株促進山蘭種子萌發的相關數據如下：真菌與山蘭種子共培養100d時開始萌發（大量種子明顯吸水變大），165d時達到最大萌發率，統計計算結果得出，接入真菌的處理組中山蘭種子均出現萌發跡象，而接入無菌瓊脂塊的對照組種子沒有任何萌發跡象，處理組的萌發率都要顯著高于對照組，且具有明顯差異；
22、促進山蘭種子萌發試驗中，4.0g/l和12.0g/l燕麥培養條件下的山蘭種子萌發率分別為20.11%和31.07%，種子都發生了吸水膨脹現象，種子種皮都發生破裂，膨大至球形，且與脆柄菇屬菌株共生萌發的種子發育的最后階段就是膨大至透明的白色球狀，即萌發階段1；8.0g/l燕麥培養條件下的種子萌發率最高接近55.26%，其中大部分種子處于萌發階段2，種皮完全破裂，種胚吸水膨脹成透明白色球體，少部分種子發育到3~4階段，長出本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種利用脆柄菇屬真菌促進山蘭種子萌發的方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的一種利用脆柄菇屬真菌促進山蘭種子萌發的方法，其特征在于：所述步驟S1中，FIM培養基：硝酸鈉0.35g、磷酸二氫鉀0.30g、硫酸鎂0.10g、氯化鉀0.15g、酵母5.00g、蔗糖2.50g、瓊脂8.00g。
3.根據權利要求1所述的一種利用脆柄菇屬真菌促進山蘭種子萌發的方法，其特征在于：所述步驟S1中，PCR擴增核糖體rDNA的內部轉錄間隔區(ITS)區域ITS1和ITS2區域，以通用引物ITS-1和ITS-4進行擴增，真菌DNA的PCR反應條件及PCR擴增程序，利用sanger測序技術對PCR產物進行測序。
4.根據權利要求1所述的一種利用脆柄菇屬真菌促進山蘭種子萌發的方法，其特征在于：所述步驟S1中，經過rDNA-ITS分子鑒定，將結果用NBCI軟件進行比對分析，參考對比中相似度最高序列真菌類別，將分離的到內生真菌鑒定為脆柄菇屬真菌。
5.根據權利要求1所述的一種利用脆柄菇屬真菌促進山蘭種子萌發的方法，其特征在于：所述步驟S3
6.根據權利要求1所述的一種利用脆柄菇屬真菌促進山蘭種子萌發的方法，其特征在于：所述步驟S4中，為山蘭種子的萌發過程三個階段：
...【技術特征摘要】
1.一種利用脆柄菇屬真菌促進山蘭種子萌發的方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的一種利用脆柄菇屬真菌促進山蘭種子萌發的方法，其特征在于：所述步驟s1中，fim培養基：硝酸鈉0.35g、磷酸二氫鉀0.30g、硫酸鎂0.10g、氯化鉀0.15g、酵母5.00g、蔗糖2.50g、瓊脂8.00g。
3.根據權利要求1所述的一種利用脆柄菇屬真菌促進山蘭種子萌發的方法，其特征在于：所述步驟s1中，pcr擴增核糖體rdna的內部轉錄間隔區(its)區域its1和its2區域，以通用引物its-1和its-4進行擴增，真菌dna的pcr反應條件及pcr擴增程...
【專利技術屬性】
技術研發人員：楊前宇，李智輝，年玉欣，付曉云，戰昊，李鈺彤，李易軒，
申請(專利權)人：沈陽農業大學，
類型：發明
國別省市：
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