本發(fā)明專利技術(shù)涉及細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域，公開了NK細(xì)胞的培養(yǎng)方法及應(yīng)用，包括準(zhǔn)備外周血或臍帶血樣本，使用Ficoll分離液從血液樣本中提取PBMC；利用NK細(xì)胞分選試劑盒，從PBMC中分離出流式細(xì)胞術(shù)檢測純度≥95％的CD3?CD56+NK細(xì)胞；將得到的CD3?CD56+NK細(xì)胞接種于NK擴(kuò)增培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)，周期為24天，擴(kuò)增培養(yǎng)基中添加一種或多種中醫(yī)多糖、IL?2和血小板裂解物，并在細(xì)胞培養(yǎng)第21天添加百里香醌。本發(fā)明專利技術(shù)提純后NK細(xì)胞增殖時(shí)間長，增殖倍數(shù)高，可持續(xù)培養(yǎng)至30天；中藥多糖促進(jìn)NK細(xì)胞的增殖效率和細(xì)胞活性及細(xì)胞因子的分泌；百里香醌72h內(nèi)能有效抑制T細(xì)胞增殖和活性，能進(jìn)一步維持NK培養(yǎng)的純度。
1、自然殺傷(nk)細(xì)胞作為癌癥免疫療法的藥物方式是有效的，因?yàn)閚k細(xì)胞可以殺死各種腫瘤細(xì)胞，而無需故意免疫、激活或事先致敏。與t細(xì)胞不同，nk細(xì)胞缺乏表面t細(xì)胞受體(tcr)，不會(huì)引起移植物抗宿主病(gvhd)，因此nk細(xì)胞具有同種異體療法的優(yōu)勢。
2、對于nk細(xì)胞在臨床上的同種異體療法應(yīng)用的關(guān)鍵是其純度和數(shù)量，研究表明，nk細(xì)胞的激活和增殖有多種途徑，包括細(xì)胞因子刺激、受體激活劑刺激和飼養(yǎng)細(xì)胞刺激，其中細(xì)胞因子刺激和受體激活劑刺激前期需要一定比例的其他淋巴細(xì)胞(如t淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等)，往往因?yàn)閭€(gè)體差異導(dǎo)致其他淋巴細(xì)胞的比例不好把控和最終的nk純度參差不齊，而飼養(yǎng)細(xì)胞刺激會(huì)引發(fā)異樣細(xì)胞的殘留，給成品的質(zhì)控帶來一定挑戰(zhàn)。使用提純后nk細(xì)胞作為增殖起點(diǎn)能有效解決nk細(xì)胞培養(yǎng)純度低的問題，但是提純后nk細(xì)胞在一般培養(yǎng)條件下的增殖較為緩慢且增殖代次有限。
3、另有研究表明，中藥多糖可以直接促進(jìn)免疫器官和免疫細(xì)胞的生長，并通過與免疫細(xì)胞表面的受體結(jié)合，激活多種信號通路，調(diào)節(jié)機(jī)體促炎因子、抗炎因子和趨化因子水平，進(jìn)而調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，維持免疫細(xì)胞的活性。以及腫瘤細(xì)胞能激活nk增殖的原理是腫瘤細(xì)胞表達(dá)的某些蛋白或信號分子直接作用于nk細(xì)胞表面受體，引發(fā)nk細(xì)胞的免疫反應(yīng)。
4、因此，探索提純后nk細(xì)胞高純度、高數(shù)量、穩(wěn)定安全的培養(yǎng)工藝是目前同種異體nk應(yīng)用所面臨的挑戰(zhàn)。
>1、根據(jù)上述提出的技術(shù)問題，而提供一種nk細(xì)胞的培養(yǎng)方法及應(yīng)用。2、本專利技術(shù)采用的技術(shù)手段如下：
3、一種nk細(xì)胞的培養(yǎng)方法，包括以下步驟：
4、(1)準(zhǔn)備100ml外周血或臍帶血樣本，使用ficoll分離液從血液樣本中提取pbmc；
5、(2)利用nk細(xì)胞分選試劑盒，通過磁珠陰選技術(shù)從pbmc中分離出流式細(xì)胞術(shù)檢測純度≥95％的cd3-cd56+nk細(xì)胞；
6、(3)將分離得到的cd3-cd56+nk細(xì)胞接種于nk擴(kuò)增培養(yǎng)基中，進(jìn)行體外培養(yǎng)，培養(yǎng)周期為24天。
7、優(yōu)選的，所述nk擴(kuò)增培養(yǎng)基的制備方法，包括以下組分：
8、(1)基礎(chǔ)培養(yǎng)基，選自dmem/f12或imdm；
9、(2)添加至培養(yǎng)基中的中藥多糖總量為50～200ug/ml，包括但不限于靈芝多糖、銀杏多糖、白及多糖、東方栓菌多糖中的一種或多種；
10、(3)添加1000u/ml的il-2以促進(jìn)細(xì)胞增殖；
11、(4)添加1％血小板裂解物以提供細(xì)胞生長因子。
12、優(yōu)選的，所述體外培養(yǎng)的過程管理包括以下步驟：
13、(1)每隔2～3天對培養(yǎng)中的nk細(xì)胞進(jìn)行補(bǔ)液操作，確保細(xì)胞密度維持在2*106cells/ml；
14、(2)在第0、9、16天分別向培養(yǎng)基中添加5～10μg/ml的人肺間皮瘤細(xì)胞提取物；
15、(3)在第21天向培養(yǎng)基中添加200μg/ml的百里香醌(thymoquinone)以增強(qiáng)細(xì)胞功能。
16、優(yōu)選的，所述人肺間皮瘤細(xì)胞提取物的制備方法，具體包括以下步驟：
17、(1)取h2052人肺間皮瘤細(xì)胞系，在含有10％?fbs和30～60μm干擾素基因刺激因子(sting)的rpmi-1640培養(yǎng)基中進(jìn)行傳代培養(yǎng)；
18、(2)接種細(xì)胞密度為100萬/ml，每隔2～3天補(bǔ)液，細(xì)胞密度維持在100萬/ml，擴(kuò)增細(xì)胞數(shù)量至50～1000倍后，離心收集細(xì)胞和培養(yǎng)液；
19、(3)用pbs洗滌細(xì)胞沉淀兩次，離心棄上清，得到純凈的細(xì)胞沉淀；
20、(4)使用含有1x蛋白酶抑制劑和1x磷酸酶抑制劑的ripa裂解和提取緩沖液，在冰浴條件下對細(xì)胞沉淀進(jìn)行破碎提取。
21、優(yōu)選的，所述人肺間皮瘤細(xì)胞破碎提取的具體操作，包括以下步驟：
22、(1)用提取緩沖液重懸細(xì)胞沉淀至1000萬/ml的濃度，每管不超過10ml；
23、(2)在冰浴條件下靜置10分鐘后輕輕搖晃均勻，重復(fù)該操作兩次，總共處理30分鐘；
24、(3)將處理后的液體分裝至1.5ml?ep管中，在4℃下12000g離心20分鐘，取上清轉(zhuǎn)移至超濾離心管中，進(jìn)行離心和洗滌；
25、(4)使用bca法檢測蛋白濃度，并用pbs將提取物定容至1mg/ml備用。
26、優(yōu)選的，培養(yǎng)環(huán)境的控制，具體為：
27、(1)將nk細(xì)胞置于溫度為37℃、環(huán)境氣氛為5％?co2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；
28、(2)確保在整個(gè)培養(yǎng)過程中，環(huán)境條件保持穩(wěn)定，無污染。
29、本專利技術(shù)還提供了一種采用上述nk細(xì)胞的培養(yǎng)方法收集的nk細(xì)胞在實(shí)體腫瘤細(xì)胞殺傷中的應(yīng)用。
30、較現(xiàn)有技術(shù)相比，本專利技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：
31、1、提純后nk細(xì)胞增殖時(shí)間長，增殖倍數(shù)高，可持續(xù)培養(yǎng)至30天；
32、2、中藥多糖能促進(jìn)nk細(xì)胞的增殖效率和細(xì)胞活性，促進(jìn)細(xì)胞因子的分泌；
33、3、高濃度的百里香醌72h內(nèi)能有效抑制t細(xì)胞增殖和活性，但對nk細(xì)胞無毒性，能進(jìn)一步維持nk培養(yǎng)的純度；
34、4、使用sting刺激培養(yǎng)的人肺間皮瘤細(xì)胞提取物相具有很強(qiáng)的nk細(xì)胞腫瘤殺傷活性和促進(jìn)能力，尤其在于殺傷實(shí)體瘤細(xì)胞的表現(xiàn)，同時(shí)也有很強(qiáng)的促nk細(xì)胞增殖能力。
35、基于上述理由本專利技術(shù)可在細(xì)胞培養(yǎng)
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【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種NK細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的NK細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述NK擴(kuò)增培養(yǎng)基的制備方法，包括以下組分：
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的NK細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述體外培養(yǎng)的過程管理包括以下步驟：
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的NK細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述人肺間皮瘤細(xì)胞提取物的制備方法，具體包括以下步驟：
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的NK細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述人肺間皮瘤細(xì)胞破碎提取的具體操作，包括以下步驟：
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的NK細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，培養(yǎng)環(huán)境的控制，具體為：
7.一種采用權(quán)利要求1-6任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的NK細(xì)胞的培養(yǎng)方法收集的NK細(xì)胞在實(shí)體腫瘤細(xì)胞殺傷中的應(yīng)用。
【技術(shù)特征摘要】
1.一種nk細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的nk細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述nk擴(kuò)增培養(yǎng)基的制備方法，包括以下組分：
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的nk細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述體外培養(yǎng)的過程管理包括以下步驟：
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的nk細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述人肺間皮瘤細(xì)胞提取物...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：劉長斌，湯曉倩，張宗申，薛永常，
申請(專利權(quán))人：大連工業(yè)大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：
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