【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及微生物，具體涉及一種高效農桿菌感受態細胞制備的方法。
技術介紹
1、對處于快速生長階段的細菌經過特殊處理，使其處于易于接受外源dna的狀態，該宿主細胞稱為“感受態細胞”。通過物理或化學方法，使外源dna分子進入受體細胞并產生新的遺傳性狀的過程稱為“轉化”。
2、農桿菌是普遍存在于土壤中的革蘭氏陰性菌，能夠向植物細胞中轉移dna，介導植物的遺傳轉化過程。農桿菌轉化是植物轉基因過程的關鍵步驟之一。質粒通過物理或化學方法轉化農桿菌感受態細胞，農桿菌攜帶外源質粒dna，將外源dna轉移并整合到植物細胞中，完成農桿菌介導的植物遺傳轉化過程。外源基因在植物中可以進行瞬時表達與穩定遺傳表達。瞬時表達時t-dna序列不需要整合到宿主基因組中，24-48h內即可完成蛋白高水平表達。而穩定遺傳轉化將t-dna整合到細胞的基因組中，需要數月產生遺傳轉化植株，獲得新的遺傳材料。
3、感受態細胞制備的方法主要為物理法和化學法。物理法主要通過電轉法進行質粒轉化且轉化效率高，然而電轉法需要昂貴的電擊設備，一般實驗室不能滿足需求。化學法制備感受態細胞主要包括cacl2法、rbcl法、inoue法等，化學轉化法操作門檻低，實驗室易于制備。然而由于農桿菌與大腸桿菌的染色體背景及細胞特性的不同，大腸桿菌感受態細胞制備的方法并不太適用于農桿菌。目前化學法制備農桿菌感受態細胞主要為cacl2法，現有的農桿菌感受態細胞制備的方法轉化效率極低。
技術實現思路
1、為解決上述技術問題，本專利
2、一種高效農桿菌感受態細胞制備的方法，具體的技術方案，包括：步驟1)農桿菌的增殖培養；步驟2)離心集菌；步驟3)用感受態制備液重懸菌體；步驟4)保存液分裝，液氮凍存；
3、本專利技術為非傳統的使用cacl2的方法制備農桿菌感受態細胞，替代的為使用氯化鎂與乙酰丁香酮相結合的方法，使農桿菌細胞的通透性增加，便于質粒dna分子轉入農桿菌感受態細胞。
4、本專利技術中使用的獨特的農桿菌感受態細胞保存液，其保存液中不含傳統的甘油、dmso等對細胞有毒性的成分，減少對感受態細胞的損傷。使用豐富的營養成分及離子作為保存液，一方面有助于感受態細胞抗凍性，另一方面有助于轉化后感受態細胞的恢復過程。
5、上述具體步驟如下所示：
6、1)將農桿菌菌株在lb(利福平25mg/l)培養基平板上劃線，于28℃培養箱中培養2天，得到單菌落；
7、2)將步驟1)中的菌落接種至5mlyeb(利福平25mg/l)培養基中，28℃過夜震蕩培養；次日將培養物接種至500ml的yeb培養基中，28℃震蕩培養至od600為0.5-0.6，冰浴30min，4000rpm、4℃離心10min，棄上清；
8、3)用20ml預冷的感受態制備液重懸菌體，4℃50-60rpm孵育10min，4000rpm、4℃離心10min，棄上清；
9、4)用20ml預冷的保存液重懸菌體，100μl/管分裝至提前預冷的ep管中，液氮速凍，-80℃冰箱保存。
10、優選的，所述步驟1)中lb固體培養基為：酵母粉5g，蛋白胨10g，氯化鈉10g，瓊脂20g，加水定容至1l。調整ph值為7.0，121℃高壓滅菌15min，倒平板。
11、優選的，所述步驟2)中yeb液體培養基為：酵母提取物1g，牛肉膏5g，蛋白胨5g，蔗糖5g，七水硫酸鎂0.5g，加水定容至1l，調整ph為7.0，121℃高壓滅菌15min。
12、優選的，所述步驟3)中感受態制備液的制備方法為：氯化鎂(10-100mm，優選為50mm)，乙酰丁香酮(50-200μm，優選為100μm)，2-嗎啉乙磺酸(10mm)，蔗糖(1-5％，優選為5％)，調整ph值為6.8，高溫高壓滅菌，4℃儲存。
13、優選的，所述步驟4)中保存液的制備方法為：在900ml純凈水中依次加入胰蛋白胨20g，酵母提取物5g，氯化鈉0.5g，氯化鉀0.186g，調整ph值為6.8，高溫高壓滅菌后，加入提前滅好的1m?mgcl2和1m?mgso4各10ml，加入20ml過濾除菌的1m葡萄糖，定容至1l，4℃儲存。
14、進一步方案中，本專利技術所制備的農桿菌感受態細胞的轉化過程通過以下步驟實現：
15、a)從-80℃取出感受態細胞，室溫融化后置于冰上，加入0.01-1μg質粒dna，輕輕混勻。
16、b)冰上靜置3min，液氮速凍3min，37℃熱擊3min，繼續冰上3min。
17、c)加入700μl的lb培養基，28℃，200rpm震蕩培養1-2h。
18、d)5000rpm離心1min，棄上清，加入100μl無菌水重懸，涂布相應的抗生素平板，28℃倒置培養2-3天。
19、本專利技術的技術效果和優點：
20、1、提高農桿菌感受態細胞的轉化效率能夠減少重復轉化的次數，有助于節約科研時間，加速后續植物遺傳轉化等分子生物學研究進程。
21、2、與現有的農桿菌感受態細胞制備技術相比，本專利技術制備的農桿菌感受態細胞操作簡單、穩定性好，轉化效率大大提高，可達2×104cfu/μg，具有較高的應用價值。
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1.一種高效農桿菌感受態細胞制備的方法，其特征在于，包括：步驟1)農桿菌的增殖培養；步驟2)離心集菌；步驟3)用感受態制備液重懸菌體；步驟4)保存液分裝，液氮凍存。
2.根據權利要求1所述的一種高效農桿菌感受態細胞制備的方法，其特征在于，具體步驟如下：
3.根據權利要求1所述的一種高效農桿菌感受態細胞制備的方法，其特征在于，所述步驟1)中LB培養基為LB固體培養基，LB固體培養基包括：酵母粉5g，蛋白胨10g，氯化鈉10g，瓊脂20g，加水定容至1L；調整pH值為7.0，121℃高壓滅菌15min，倒平板。
4.根據權利要求3所述的一種高效農桿菌感受態細胞制備的方法，其特征在于，所述步驟2)中YEB培養基為YEB液體培養基，YEB液體培養基包括：酵母提取物1g，牛肉膏5g，蛋白胨5g，蔗糖5g，七水硫酸鎂0.5g，加水定容至1L；調整pH為7.0，121℃高壓滅菌15min。
5.根據權利要求1所述的一種高效農桿菌感受態細胞制備的方法，其特征在于，所述步驟3)中感受態制備液的制備方法為：10-100mM氯化鎂，50-200μM乙酰丁
6.根據權利要求1所述的一種高效農桿菌感受態細胞制備的方法，其特征在于，所述步驟4)中保存液的制備方法為：在900mL純凈水中依次加入胰蛋白胨20g，酵母提取物5g，氯化鈉0.5g，氯化鉀0.186g；調整pH值為6.8，高溫高壓滅菌后，加入提前滅菌好的1M?MgCl2和1MMgSO4各10mL，加入20mL過濾除菌的1M葡萄糖，定容至1L，4℃儲存。
7.根據權利要求5所述的一種高效農桿菌感受態細胞制備的方法，其特征在于，所述感受態制備液包括：50mM氯化鎂，100μM乙酰丁香酮，10mM2-嗎啉乙磺酸，5％蔗糖。
8.根據權利要求4所述的一種高效農桿菌感受態細胞制備的方法，其特征在于，所述LB培養基、YEB培養基均含有25mg/L利福平。
9.根據權利要求1-8任一所述的一種高效農桿菌感受態細胞制備的方法，其特征在于，本專利技術所制備的農桿菌感受態細胞的轉化過程通過以下步驟實現：
10.根據權利要求1-9所述的一種高效農桿菌感受態細胞制備的方法，其特征在于，本專利技術所制備的農桿菌感受態細胞的轉化效率達到2×104cfu/μg。
...【技術特征摘要】
1.一種高效農桿菌感受態細胞制備的方法，其特征在于，包括：步驟1)農桿菌的增殖培養；步驟2)離心集菌；步驟3)用感受態制備液重懸菌體；步驟4)保存液分裝，液氮凍存。
2.根據權利要求1所述的一種高效農桿菌感受態細胞制備的方法，其特征在于，具體步驟如下：
3.根據權利要求1所述的一種高效農桿菌感受態細胞制備的方法，其特征在于，所述步驟1)中lb培養基為lb固體培養基，lb固體培養基包括：酵母粉5g，蛋白胨10g，氯化鈉10g，瓊脂20g，加水定容至1l；調整ph值為7.0，121℃高壓滅菌15min，倒平板。
4.根據權利要求3所述的一種高效農桿菌感受態細胞制備的方法，其特征在于，所述步驟2)中yeb培養基為yeb液體培養基，yeb液體培養基包括：酵母提取物1g，牛肉膏5g，蛋白胨5g，蔗糖5g，七水硫酸鎂0.5g，加水定容至1l；調整ph為7.0，121℃高壓滅菌15min。
5.根據權利要求1所述的一種高效農桿菌感受態細胞制備的方法，其特征在于，所述步驟3)中感受態制備液的制備方法為：10-100mm氯化鎂，50-200μm乙酰丁香酮，10mm?2-嗎啉乙磺酸，1-5％蔗糖，調...
【專利技術屬性】
技術研發人員：趙瑞，王奕達，李雙樂，
申請(專利權)人：北京酷來搏科技有限公司，
類型：發明
國別省市：
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