【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)專利涉及一種用于定量檢測cho細(xì)胞dna片段大小分布的引物對及其應(yīng)用，屬于生物檢測。
技術(shù)介紹
1、在上市和臨床試驗的生物藥中，70％來自哺乳動物細(xì)胞表達(dá)體系，其中，哺乳動物cho細(xì)胞系是目前表達(dá)制備生物制品最廣泛的宿主細(xì)胞，近幾年仍將繼續(xù)作為生產(chǎn)生物制品的主要宿主細(xì)胞。生物制品(如疫苗、抗體藥物、基因藥物等)在制備過程中，多使用傳代細(xì)胞株進(jìn)行生產(chǎn)，嚴(yán)格的純化工藝可以去除一部分宿主細(xì)胞的dna片段，但產(chǎn)品中仍有可能會有殘留雜質(zhì)，這些宿主細(xì)胞殘留dna可能會傳遞腫瘤或病毒相關(guān)基因，存在潛在的危險性。《中華人民共和國藥典》2020年版第三部規(guī)定，康柏西普dna殘留量≤30pg/mg，重組乙型肝炎疫苗(cho細(xì)胞)dna殘留量應(yīng)不高于10pg/劑。因此，cho宿主細(xì)胞dna檢測項目是生物制品生產(chǎn)工藝中重要的質(zhì)量檢測指標(biāo)之一。
2、相關(guān)研究表明，基因的大小普遍在200bp以上，因此大于200bp的殘留dna片段可能會有一定的致病性，而且殘留dna片段越大，生物制品的風(fēng)險等級越高。因此，各國監(jiān)管機(jī)構(gòu)對其提出了嚴(yán)格要求。美國食品藥品監(jiān)督管理局(fda)關(guān)于人類基因治療新產(chǎn)品生產(chǎn)指導(dǎo)文件中明確指出hcd(宿主細(xì)胞dna)的片段要小于200bp；2022年5月，國家藥品監(jiān)督管理局藥品評審中心(cde)發(fā)布的《體內(nèi)基因治療產(chǎn)品藥學(xué)研究與評價技術(shù)指導(dǎo)原則(試行)》中也明確指出需對dna殘留量和殘留片段大小進(jìn)行控制，建議盡量將dna殘留片段的大小控制在200bp以下。因此，定量檢測使用cho宿主細(xì)胞表達(dá)抗體和重組蛋白，以及蛋白純
3、目前，市場上主要的分析殘留宿主細(xì)胞dna片段的方法是毛細(xì)管電泳的方法，研究者們開發(fā)了一種基于毛細(xì)管凝膠電泳與敏感激光誘導(dǎo)熒光(cge-lif)檢測殘留dna分子大小的方法，可以檢測生物制品中殘留dna的大小。實驗表明，大多數(shù)宿主細(xì)胞殘留dna片段大小為50～2000bp。除了毛細(xì)管電泳法外，市場上還存在基于qpcr進(jìn)行生物制品中生產(chǎn)用細(xì)胞相關(guān)的dna片段檢測的試劑盒，相比于cge-lif操作更簡單，耗時更短。
4、由于國內(nèi)外監(jiān)管機(jī)構(gòu)對于生物制品中宿主細(xì)胞dna的殘留量和殘留dna片段的大小分布等有強(qiáng)烈的關(guān)注，所以對cho細(xì)胞的殘留dna片段殘留量和殘留片段大小的檢測分析有著迫切的需求，但尚未見相關(guān)報道。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)提供了一種用于定量檢測cho細(xì)胞dna片段大小分布的引物對。
2、本專利技術(shù)采用的技術(shù)方案為：
3、一種用于定量檢測cho細(xì)胞dna片段大小分布的引物對，至少包括以下描述的一組引物對：各引物對中的正向引物和反向引物分別特異性結(jié)合于seq?id?no:1所示區(qū)段，且其中一組引物對的擴(kuò)增產(chǎn)物的長度在100bp以下，一組引物對的擴(kuò)增產(chǎn)物的長度在100-199bp，一組引物對的擴(kuò)增產(chǎn)物的長度在200-500bp，一組引物對的擴(kuò)增產(chǎn)物的長度在500bp以上。
4、優(yōu)選的，所述引物對是指第一引物對、第二引物對、第三引物對或第四引物對；
5、其中第一引物對的正向引物結(jié)合于seq?id?no:1所示序列的第113-156位；反向引物結(jié)合于seq?id?no:1所示序列的第184-221位，并且所述引物對的擴(kuò)增產(chǎn)物的長度為90-98bp；
6、第二引物對的正向引物結(jié)合于seq?id?no:1所示序列的第101-156位；反向引物結(jié)合于seq?id?no:1所示序列的第184-221位，并且所述引物對的擴(kuò)增產(chǎn)物的長度為105-120bp；
7、第三引物對的正向引物結(jié)合于seq?id?no:1所示序列的第101-156位；反向引物結(jié)合于seq?id?no:1所示序列的第282-320位，并且所述引物對的擴(kuò)增產(chǎn)物的長度為200-220bp；
8、第四引物對的正向引物結(jié)合于seq?id?no:1所示序列的第37-153位；反向引物結(jié)合于seq?id?no:1所示序列的第526-638位，并且所述引物對的擴(kuò)增產(chǎn)物的長度為500-557bp。
9、優(yōu)選的，其中第一引物對包括seq?id?no:3所示的正向引物和seq?id?no:7所示的反向引物，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為92bp；
10、其中第二引物對包括seq?id?no:2所示的正向引物和seq?id?no:8所示的反向引物，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為115bp；
11、其中第三引物對包括seq?id?no:2所示的正向引物和seq?id?no:9所示的反向引物，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為204bp；
12、其中第四引物對包括seq?id?no:3所示的正向引物和seq?id?no:10所示的反向引物，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為511bp。
13、本專利技術(shù)還公開了一種用于定量檢測cho細(xì)胞dna片段大小分布的引物對組合，包括所述的引物對中的至少三對，更優(yōu)選的，包括上述的第一引物對、第二引物對和第四引物對；或者上述的第一引物對、第三引物對和第四引物對；或者包括上述的第一引物對、第二引物對、第三引物對和第四引物對。
14、本專利技術(shù)還公開了一種用于定量檢測cho細(xì)胞dna片段大小分布的試劑盒，包括上述的引物對或者引物對組合。
15、優(yōu)選的，還包括探針。
16、優(yōu)選的，所述探針的核苷酸序列如seq?id?no:15所示。
17、優(yōu)選的，所述探針一端標(biāo)記有熒光報告基團(tuán)fam，另一端標(biāo)記有淬滅基團(tuán)bhq1。
18、試劑盒中還可以包括其他qpcr檢測所需的試劑，例如酶、buffer等等。
19、本專利技術(shù)還公開了上述的引物對、引物對組合或上述的試劑盒在體外定量檢測cho細(xì)胞dna片段大小分布中的應(yīng)用。
20、本專利技術(shù)還公開了一種定量檢測cho細(xì)胞dna片段大小分布的方法，以上述的引物對或引物對組合作為引物，對待測樣品進(jìn)行qpcr，并檢測qpcr擴(kuò)增產(chǎn)物；或者采用上述的試劑盒，對待測樣品進(jìn)行qpcr，并檢測qpcr擴(kuò)增產(chǎn)物。
21、優(yōu)選的，待測樣品來自基于cho細(xì)胞基質(zhì)培育制備的疫苗、重組蛋白藥、抗體藥中的任意一種。
22、本專利技術(shù)的有益效果如下：
23、(1)本專利技術(shù)的目的是提供一種采用實時熒光定量pcr(real-time?qpcr)技術(shù)定量檢測cho殘留dna片段的引物對及試劑，其能夠用于分析生物制品中間品、成品中的cho殘留dna片段，有利于改進(jìn)工藝、提高產(chǎn)品質(zhì)量，用于產(chǎn)品質(zhì)量控制和放行。
24、(2)利用所述引物探針的qpcr檢測方法操作簡便快捷，從獲得樣品到給出檢測報告只需3h；靈敏度高，定量限均為3fg/μl；專屬性強(qiáng)，能區(qū)分小鼠基因組、e.coli、mdck細(xì)胞、hek293、vero細(xì)胞、畢赤酵母細(xì)胞等干擾性dna。
本文檔來自技高網(wǎng)...【技術(shù)保護(hù)點】
1.一種用于定量檢測CHO細(xì)胞DNA片段大小分布的引物對，其特征在于，至少包括以下描述的一組引物對：各引物對中的正向引物和反向引物分別特異性結(jié)合于SEQ?ID?NO:1所示區(qū)段，且其中一組引物對的擴(kuò)增產(chǎn)物的長度在100bp以下，一組引物對的擴(kuò)增產(chǎn)物的長度在100-199bp，一組引物對的擴(kuò)增產(chǎn)物的長度在200-500bp，一組引物對的擴(kuò)增產(chǎn)物的長度在500bp以上。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物對，其特征在于，所述引物對是指第一引物對、第二引物對、第三引物對或第四引物對；
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的引物對，其特征在于，
4.一種用于定量檢測CHO細(xì)胞DNA片段大小分布的引物對組合，其特征在于，包括權(quán)利要求2或3中所述的引物對中的至少三對。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所示的引物對組合，其特征在于，包括權(quán)利要求2或3中的第一引物對、第二引物對和第四引物對；或者包括權(quán)利要求2或3中所述的第一引物對、第三引物對和第四引物對；或者包括權(quán)利要求2或3中所述的第一引物對、第二引物對、第三引物對和第四引物對。
6.一種用于定量檢測CHO細(xì)胞DNA
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，還包括探針。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述探針的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:15所示。
9.產(chǎn)品在體外定量檢測CHO細(xì)胞DNA片段大小分布中的應(yīng)用，其中產(chǎn)品是指權(quán)利要求1-3中任一項所述的引物對，或權(quán)利要求4或5所述的引物對組合，或權(quán)利要求6-8中任一項所述的試劑盒。
10.一種定量檢測CHO細(xì)胞DNA片段大小分布的方法，其特征在于，以權(quán)利要求1-3中任一項所述的引物對或權(quán)利要求4或5中所述的引物對組合作為引物，對待測樣品進(jìn)行qPCR，并檢測qPCR擴(kuò)增產(chǎn)物；或者采用權(quán)利要求6-8中任一項所述的試劑盒，對待測樣品進(jìn)行qPCR，并檢測qPCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種用于定量檢測cho細(xì)胞dna片段大小分布的引物對，其特征在于，至少包括以下描述的一組引物對：各引物對中的正向引物和反向引物分別特異性結(jié)合于seq?id?no:1所示區(qū)段，且其中一組引物對的擴(kuò)增產(chǎn)物的長度在100bp以下，一組引物對的擴(kuò)增產(chǎn)物的長度在100-199bp，一組引物對的擴(kuò)增產(chǎn)物的長度在200-500bp，一組引物對的擴(kuò)增產(chǎn)物的長度在500bp以上。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物對，其特征在于，所述引物對是指第一引物對、第二引物對、第三引物對或第四引物對；
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的引物對，其特征在于，
4.一種用于定量檢測cho細(xì)胞dna片段大小分布的引物對組合，其特征在于，包括權(quán)利要求2或3中所述的引物對中的至少三對。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所示的引物對組合，其特征在于，包括權(quán)利要求2或3中的第一引物對、第二引物對和第四引物對；或者包括權(quán)利要求2或3中所述的第一引物對、第三引物對和第四引物對；或者包括權(quán)利要求2或3...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：巫月，黃淑云，
申請(專利權(quán))人：翌圣生物科技上海股份有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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