【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及醫療，具體的說是一種基于非偶聯自富集信號放大的鉑納米點探針檢測ctn?i的方法。
技術介紹
1、隨著心血管疾病的發病率持續攀升，對于心肌損傷標志物的檢測技術也日益受到醫學界的密切關注。眾多研究已經揭示，一旦心肌細胞遭受損傷或壞死，心肌肌鈣蛋白便會被釋放至血液中。在這些蛋白中，心肌肌鈣蛋白i(ctn?i)因其高度的敏感性和特異性，自20世紀90年代被發現之日起，便在心血管疾病的診斷與風險評估領域占據了重要地位。目前，針對ctn?i的臨床檢測主要采用免疫學方法，這些方法包括酶聯免疫吸附試驗、化學發光免疫分析、免疫層析以及熒光免疫吸附實驗。盡管這些免疫分析技術具備高通量、高特異性和高靈敏度等一系列顯著優勢，但常規的免疫分析方法在檢測低水平生物標志物時仍顯得力不從心。因此，進一步提升檢測技術的靈敏度，以便更精準地監測心肌肌鈣蛋白的細微變化，對于為患者提供更為精確的輔助診斷信息具有重要意義。
2、在目前的定量檢測方法中，酪胺信號放大策略(tsa)憑借其顯著提升靈敏度和準確性的能力引起了廣泛關注。基于酪胺及其衍生物的功能性hrp和酪胺轉化酶，已被巧妙地設計成信號放大單元，并成功應用于標志物的高靈敏度檢測，為生物醫學研究提供了強有力的工具。然而，酪胺偶聯生物酶信號放大單元的制備過程并非一帆風順。它至少涉及三個繁瑣的步驟：生物酶的預活化、偶聯反應以及復合物的純化。其中，偶聯反應需要昂貴的偶聯劑，這無疑增加了實驗成本。更棘手的是，酪胺偶聯反應通常需要精確控制ph和溫度，這使得整個偶聯過程不僅耗時較長，復雜程度高，還容易導
技術實現思路
1、為解決上述技術問題，本專利技術提供了一種基于非偶聯自富集信號放大的鉑納米點探針檢測ctn?i的方法，基于鉑納米點的一步法合成與修飾及其高效的過氧化化物模擬酶性能，此方法提高了ctn?i檢測的靈敏度。即通過ctni及其抗體形成的夾心結構，由hrp標記抗體活化的鉑納米點進一步與酶標板內的蛋白結合并富集，結合高效快速的催化反應實現對ctn?i的定量分析。該方法易于操作、靈敏度高、特異性強、可實現高通量，精準靶向及無損檢測等特點。
2、一種基于非偶聯自富集信號放大的鉑納米點探針檢測ctn?i的方法，所述方法包括以下步驟：
3、a、鉑納米點的一步法制備；
4、b、將ctn?i捕獲抗體包被在酶標板中，封閉后加入不同濃度的ctn?i標準品，捕獲后加入hrp標記的檢測抗體，洗滌后加入鉑納米點和h2o2，顯色后建立基于鉑納米點的自富集信號放大策略定量ctn?i；
5、c、以ctn?i標準品濃度的對數為橫坐標，吸光強度值為縱坐標繪制標準曲線，從而定量檢測出ctn?i的濃度。
6、所述標準曲線的線性方程為y＝1.92+0.93c，其中y表示紫外吸光強度，c為ctn?i濃度。相關系數r2＝0.992，線性范圍為0.012-0.19ng/ml，檢出限為3pg/ml。
7、所述步驟a具體包括以下步驟：
8、a-1、鉑納米點的制備：首先將氯鉑酸鉀離心，去除顆粒狀物質。然后，將1ml的酪氨酸溶液過濾分離。將28ml、20mm的氯鉑酸鉀與2ml、60mm的酪氨酸混合，室溫攪拌10min后，繼續加熱至煮沸，快速注入0.1ml、0.5％的硼氫化鈉，劇烈攪拌5min，冷卻至室溫后得到酪氨酸功能化的鉑納米點。
9、a-2、鉑納米點的純化：取鉑納米點溶液于離心管中，在20000rpm/min下離心30min，除去上清液中未反應的前驅體和其他離子，將獲得的鉑納米點分散于超純水中并在4℃條件下儲存。
10、所述步驟a中根據一步水熱法合成了酪氨酸修飾的鉑納米點，并將其作為酪胺信號放大單元；相比于傳統偶聯法獲得的酪胺單元，該方法具有一步法制備的特點，無需偶聯試劑的技術優勢。
11、所述步驟b具體包括以下步驟：
12、b-1、形成抗體-ctn?i-抗體復合物：將10ng/ml的捕獲抗體包被在酶標板中，封閉后加入ctn?i抗原孵育，再加入hrp標記的捕獲抗體孵育，以形成抗體-ctni-抗體夾心結構；
13、b-2、鉑納米點活化：將0.05ml的鉑納米點加到已經形成夾心結構的酶標板中，快速加入0.01ml、2mm的h2o2，室溫活化2min；
14、b-3、鉑納米點的自富集：將活化后的體系置于37度恒溫箱中繼續反應5min，促進鉑納米點在酶標板中的富集；
15、b-4、檢測：pbst溶液洗滌3次，除去未結合的鉑納米點,加入顯色液，用多功能酶標儀測定各孔在490nm處的光密度值。
16、所述步驟b中首先將分析物ctn?i在酶標板中形成夾心結構復合物；利用hrp標記抗體催化h2o2產生活性氧，進一步活化鉑納米點，隨后，酪胺修飾的鉑納米點在酶標板中與孔內蛋白進行自組裝并富集；與傳統生物酶催化顯色法相比，該方法引入了鉑納米點納米酶增加了體系的有效催化單元，實現了高效的信號放大，具有提高檢測靈敏度的技術優勢。
17、與現有技術相比，本專利技術具有以下幾個特點：
18、(1)利用酪氨酸作為保護劑和保護劑，一步水熱制備了酶可激活的鉑納米點，為酪胺信號放大單元的簡便制備提供了新方法；
19、(2)利用酶標板作為酪胺修飾鉑納米點信號放大的有效載體，賦予了酪胺信號放大策略的普適性；
20、(3)利用鉑納米點的高催化活性，酶可激活的特性，結合高通量的酶標板載體，為ctni的高靈敏檢測提供了新策略。
21、(4)該方法操作簡便、靈敏度高、特異性強、可實現高通量無損定量檢測。
22、本專利技術提供了一種基于非偶聯自富集信號放大的鉑納米點探針檢測ctn?i的方法，結合鉑納納米酶卓越的催化活性和酶激活啟動酪胺修飾鉑納米點自富集的特性實現了ctn?i的高靈敏檢測。
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1.一種基于非偶聯自富集信號放大的鉑納米點探針檢測cTn?I的方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的一種基于非偶聯自富集信號放大的鉑納米點探針檢測cTn?I的方法，其特征在于，步驟a具體包括以下步驟：
3.根據權利要求2所述的一種基于非偶聯自富集信號放大的鉑納米點探針檢測cTn?I的方法，其特征在于，步驟b具體包括以下步驟：
4.根據權利要求3所述的一種基于非偶聯自富集信號放大的鉑納米點探針檢測cTn?I的方法，其特征在于：步驟c中所述標準曲線的線性方程為Y＝1.92+0.93C，其中Y為吸光強度值，C為cTn?I濃度。
5.根據權利要求4所述的一種基于非偶聯自富集信號放大的鉑納米點探針檢測cTn?I的方法，其特征在于，所述線性方程的相關系數R2＝0.992，線性范圍為0.012-0.19ng/mL，檢出限為3pg/mL。
【技術特征摘要】
1.一種基于非偶聯自富集信號放大的鉑納米點探針檢測ctn?i的方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的一種基于非偶聯自富集信號放大的鉑納米點探針檢測ctn?i的方法，其特征在于，步驟a具體包括以下步驟：
3.根據權利要求2所述的一種基于非偶聯自富集信號放大的鉑納米點探針檢測ctn?i的方法，其特征在于，步驟b具體包括以下步驟：
4.根據權利要求...
【專利技術屬性】
技術研發人員：呂坤，李磊，鐘民，
申請(專利權)人：皖南醫學院第一附屬醫院皖南醫學院弋磯山醫院，
類型：發明
國別省市：
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