【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專(zhuān)利技術(shù)屬于基因工程，具體涉及一種合成巖藻糖基乳糖的基因工程菌及其制備方法和應(yīng)用，尤其涉及一種合成2’-巖藻糖基乳糖或3-巖藻糖基乳糖的基因工程菌及其制備方法和應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、母乳低聚糖(human?milk?oligosaccharides，hmos)是人類(lèi)母乳中僅次于乳糖和脂肪的第三大固體組分，是重要的天然益生元。hmos在許多生理功能上起到了重要的作用，例如有助于新生兒腸道菌群的定植；通過(guò)調(diào)節(jié)基因表達(dá)和細(xì)胞因子的產(chǎn)生來(lái)調(diào)節(jié)腸道上皮細(xì)胞功能和免疫反應(yīng)；作為抗粘附型抗菌劑降低腸道病原微生物的感染，降低壞死性小腸結(jié)腸炎發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)和為新生兒提供唾液酸作為大腦發(fā)育和認(rèn)知力提高的必要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。2’-巖藻糖基乳糖(2’-fucosyllactose，2’-fl)和3-巖藻糖基乳糖(3-fucosyllactose，3-fl)是母乳中含量最豐富的一類(lèi)巖藻糖基低聚糖，能選擇性的增強(qiáng)雙歧桿菌的生長(zhǎng)并形成與腸黏膜細(xì)胞表面多糖類(lèi)似的受體，從而保護(hù)嬰兒防止腸道病原微生物的侵襲。2’-fl和3-fl作為母乳低聚糖中含量最高的成分，由于其獨(dú)特的益生特性而受到廣泛關(guān)注，具備應(yīng)用于嬰幼兒配方物的廣泛前景。
2、目前，巖藻糖基乳糖(2’-fl和3-fl)的生產(chǎn)方法主要為化學(xué)法、酶法和生物合成法等。其中，化學(xué)法步驟繁瑣，副產(chǎn)物多且環(huán)境污染大；酶法底物價(jià)格昂貴，酶催化活性低且無(wú)法實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)要求。近些年來(lái)，利用系統(tǒng)生物學(xué)和代謝工程等技術(shù)構(gòu)建基因工程菌(特別是大腸桿菌基因工程菌)生產(chǎn)巖藻糖基乳糖越來(lái)越受到研究者的關(guān)注。但是作為原核表達(dá)宿主的e
3、因此，尋找一種不含內(nèi)毒素的大腸桿菌作為宿主菌，將極大地簡(jiǎn)化產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)過(guò)程中目標(biāo)產(chǎn)物的純化并提高目標(biāo)產(chǎn)物的使用安全性。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本專(zhuān)利技術(shù)的目的在于提供一種合成巖藻糖基乳糖的基因工程菌及其制備方法和應(yīng)用。所述基因工程菌以益生大腸桿菌nissle1917(ecn)為宿主菌，其不含腸毒素、溶血毒素和細(xì)胞毒素等致病因子，對(duì)宿主無(wú)安全風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)其進(jìn)行基因改造，構(gòu)建能合成巖藻糖基乳糖的工程菌，從而實(shí)現(xiàn)巖藻糖基乳糖高效發(fā)酵合成，同時(shí)解決產(chǎn)品安全性問(wèn)題，克服現(xiàn)有以e.coli為宿主進(jìn)行巖藻糖基乳糖生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生細(xì)菌內(nèi)毒素的不足，為實(shí)現(xiàn)其工業(yè)化大規(guī)模安全性生產(chǎn)提供基礎(chǔ)。
2、為達(dá)到此專(zhuān)利技術(shù)目的，本專(zhuān)利技術(shù)采用以下技術(shù)方案：
3、第一方面，本專(zhuān)利技術(shù)提供一種合成巖澡糖基乳糖的基因工程菌，所述基因工程菌是在初始菌株的基礎(chǔ)上敲除了十一磷酸葡萄糖-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶基因wcaj和β-半乳糖苷酶基因lacz，過(guò)表達(dá)磷酸甘露糖酶基因manb、磷酸鳥(niǎo)嘌呤轉(zhuǎn)移酶基因manc、gdp-甘露糖-4,6-脫水酶基因gmd、gdp-fucose合成酶基因wcag和β-半乳糖苷透性酶基因lacy，進(jìn)一步的，還過(guò)表達(dá)α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因或α-1,3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因。
4、優(yōu)選的，所述基因工程菌還過(guò)表達(dá)糖外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因。
5、優(yōu)選的，所述糖外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因?yàn)閬?lái)源自大腸桿菌k-12mg1655的seta、ydea、mdfa、setb基因，核苷酸序列如seq?id?no.16-seq?id?no.19所示，伯氏耶爾森菌(yersiniabercovieri)的tpyb，核苷酸序列如seq?id?no.20所示，或粗糙脈孢菌(neurosporacrassa)的cdt2，核苷酸序列如seq?id?no.21所示；更優(yōu)選的，所述糖外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因?yàn)椴弦疇柹?yersinia?bercovieri)的tpyb，核苷酸序列如seq?id?no.20所示。
6、優(yōu)選的，所述基因工程菌還敲除了蛋白酶基因lon、6-磷酸果糖激酶基因pfka或gdp-甘露糖基水解酶nudd中的一個(gè)或多個(gè)。
7、優(yōu)選的，所述初始菌株選自大腸桿菌選自bl21(de3)或整合了t7?rna聚合酶表達(dá)框的nissle?1917工程菌。
8、優(yōu)選的，整合了t7?rna聚合酶(t7rnap)表達(dá)框的nissle?1917工程菌的改造方法按照專(zhuān)利cn202310516515.6中所述的方法進(jìn)行優(yōu)化和改造而成。
9、優(yōu)選的，所述整合了t7?rna聚合酶表達(dá)框的nissle?1917工程菌的遺傳改造包括：在nissle?1917的基因組上插入t7?rna聚合酶表達(dá)框，敲除基因組上的enda基因和ompt基因，敲除隱秘質(zhì)粒pmut1和pmut2。
10、優(yōu)選的，t7?rna聚合酶表達(dá)框包括啟動(dòng)子序列、操縱子序列、rbs序列、間隔序列以及位于rbs下游間隔序列下游的t7rna聚合酶序列(gene?id:1261050)，其5’端如seq?idno.72所示，改造和優(yōu)化后的t7rnap表達(dá)框序列如seq?id?no.73所示。
11、優(yōu)選的，所述敲除為采用crispr基因編輯或同源重組的方法進(jìn)行基因敲除/沉默，從而下調(diào)或去除相關(guān)基因的功能。
12、優(yōu)選的，所述過(guò)表達(dá)是將manb、manc、gmd、wcag、lacy基因與α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因整合到一個(gè)或者多個(gè)外源質(zhì)粒上并導(dǎo)入至初始菌株中表達(dá)，所述外源質(zhì)粒選自petduet、pcoladuet、prsfduet或pcdfduet中任意一種或者至少兩種的組合。
13、優(yōu)選的，所述過(guò)表達(dá)是將manb、manc、gmd、wcag、lacy基因與α-1,3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因整合到一個(gè)或者多個(gè)外源質(zhì)粒上并導(dǎo)入至初始菌株中表達(dá)，所述外源質(zhì)粒選自petduet、pcoladuet、prsfduet或pcdfduet中任意一種或者至少兩種的組合。
14、優(yōu)選的，所述α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因來(lái)源于脆弱擬桿菌(bacteroidesfragilis)、幽門(mén)螺旋桿菌(helicobacter?pylori)、大腸桿菌o86(e.coli?o86)、產(chǎn)脂固氮螺菌(a.lipoferum)或螺桿菌13s00401-1(helicobacter?sp.13s00401-1)，其核苷酸序列經(jīng)大腸桿菌密碼子優(yōu)化后如seq?id?no.6-seq?id?no.10所示；更優(yōu)選的，所述α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因來(lái)源于脆弱擬桿菌(bacteroides?fragilis)的wcfb，其核苷酸序列經(jīng)大腸桿菌密碼子優(yōu)化后如seq?id?no.6所示。
15、優(yōu)選的，所述α-1,3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因來(lái)源于幽門(mén)螺旋桿菌(helicobacterpylori)、嚙齒螺桿菌(helicoba本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種合成巖澡糖基乳糖的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是在初始菌株的基礎(chǔ)上敲除了十一磷酸葡萄糖-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶基因wcaJ和β-半乳糖苷酶基因lacZ，過(guò)表達(dá)磷酸甘露糖酶基因manB、磷酸鳥(niǎo)嘌呤轉(zhuǎn)移酶基因manC、GDP-甘露糖-4,6-脫水酶基因gmd、GDP-fucose合成酶基因WcaG和β-半乳糖苷透性酶基因lacY，進(jìn)一步的，還過(guò)表達(dá)α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因或α-1,3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌還過(guò)表達(dá)糖外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因；
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌還敲除了蛋白酶基因lon、6-磷酸果糖激酶基因pfkA或GDP-甘露糖基水解酶nudD中的一個(gè)或多個(gè)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的基因工程菌，其特征在于，所述初始菌株選自大腸桿菌選自BL21(DE3)或整合了T7?RNA聚合酶表達(dá)框的Nissle?1917工程菌；
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的基因工程菌，其特征在，所述敲除為采用CRISPR基因編
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的合成巖澡糖基乳糖的基因工程菌在合成α-1,2-巖藻糖基乳糖或3-巖藻糖基乳糖中的應(yīng)用。
7.一種權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的合成巖澡糖基乳糖的基因工程菌的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括：
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的合成巖澡糖基乳糖的基因工程菌的制備方法，其特征在于，還在外源質(zhì)粒上整合糖外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因；
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的合成巖澡糖基乳糖的基因工程菌的制備方法，其特征在于，所述初始菌株為選自大腸桿菌選自BL21(DE3)或整合了T7?RNA聚合酶表達(dá)框的Nissle1917工程菌；
10.根據(jù)權(quán)利要求7-9中任一項(xiàng)所述的合成巖澡糖基乳糖的基因工程菌的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中采用pETDuet、pCOLADuet或pRSFDuet質(zhì)粒串聯(lián)過(guò)表達(dá)manB、manC、gmd和WcaG基因，利用pCDFDuet質(zhì)粒串聯(lián)過(guò)表達(dá)lacY、α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因和tpyB基因；
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種合成巖澡糖基乳糖的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是在初始菌株的基礎(chǔ)上敲除了十一磷酸葡萄糖-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶基因wcaj和β-半乳糖苷酶基因lacz，過(guò)表達(dá)磷酸甘露糖酶基因manb、磷酸鳥(niǎo)嘌呤轉(zhuǎn)移酶基因manc、gdp-甘露糖-4,6-脫水酶基因gmd、gdp-fucose合成酶基因wcag和β-半乳糖苷透性酶基因lacy，進(jìn)一步的，還過(guò)表達(dá)α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因或α-1,3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌還過(guò)表達(dá)糖外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因；
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌還敲除了蛋白酶基因lon、6-磷酸果糖激酶基因pfka或gdp-甘露糖基水解酶nudd中的一個(gè)或多個(gè)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的基因工程菌，其特征在于，所述初始菌株選自大腸桿菌選自bl21(de3)或整合了t7?rna聚合酶表達(dá)框的nissle?1917工程菌；
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的基因工程菌，其特征在，所述敲除為采用cris...
【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：許本宏，石雅南，王晨舒，袁珊，迮曉雷，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：湯臣倍健股份有限公司，
類(lèi)型：發(fā)明
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