【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種人重組促紅細胞生成素來源的質譜鑒定方法及應用，涉及g01n，具體涉及測量，測試的方法。
技術介紹
1、促紅細胞生成素是一種人體內源性糖蛋白激素，受缺氧誘導因子調控，主要由腎臟合成分泌，可刺激紅細胞的增殖，促進造血。促紅細胞生成素在臨床藥物中廣泛應用，主要用于治療慢性腎性貧血，癌癥相關性貧血等貧血性疾病。rhepo及其類似物可增加血氧飽和度，因此也可用于生產興奮劑類藥物。目前采用的促紅細胞生成素多為小鼠卵巢細胞培養的促紅細胞生成素或鼠源促紅細胞生成素，但是存在一定的人體排斥風險。為了降低排斥反應，人內源促紅細胞生成素逐漸在醫藥等臨床領域中使用?，F階段血清/血漿等復雜基質中促紅細胞生成素類興奮劑的通用檢測方法，還是基于十二烷基肌氨酸鈉的凝膠電泳聯合免疫印記，化學發光檢測方法。由于人內源epo(促紅細胞生成素)與rhepo(重組人促紅細胞生成素)的條帶十分接近，使得檢測結果準確度不夠理想，易產生室間差異，影響興奮劑檢出、臨床診斷和用藥。
2、中國專利技術專利cn202210601700.0公開了一種重組人促紅細胞生成素的含量檢測方法，采用高效液相色譜法檢測重組人促紅細胞生成素的含量，檢測方法的檢測準確度高、操作簡單，但是無法實現人源和鼠源的促紅細胞生成素的區分。中國專利技術專利cn201610900013.3公開了一種促紅細胞生成素興奮劑試劑盒及其檢測方法，基于核酸適體熒光探針的促紅細胞生成素試劑盒，檢測操作簡單快速，無需復雜樣品加工和分離，但是與鼠源促紅細胞生成素的區分效果不理想，檢測準確度不高。>
技術實現思路
1、為了提高促紅細胞生成素的來源檢測的準確度，本專利技術的第一個方面提供了一種人重組促紅細胞生成素來源的質譜鑒定方法，包括以下步驟：
2、s1將生物素與促紅細胞生成素抗體結合，得到促紅細胞生成素抗體a，將待測樣品與促紅細胞生成素抗體a共孵育，促紅細胞生成素抗體a與樣品中的促紅細胞生成素蛋白結合，得混合物1；
3、s2使用鏈霉親和素包被的磁珠與混合物1共孵育，實現促紅細胞生成素的純化；
4、s3對純化后的促紅細胞生成素進行還原烷基化，胰蛋白酶酶切；
5、s4采用質譜儀對酶切后的促紅細胞生成素的肽段進行定性檢測。
6、作為一種優選的實施方式，所述促紅細胞生成素選自人內源促紅細胞生成素(epo)或重組人促紅細胞生成素(rhepo)，所述重組人促紅細胞生成素選自鼠卵巢細胞(cho)培養的重組人促紅細胞生成素或人胚胎腎細胞293(hek293)培養的重組人促紅細胞生成素。
7、作為一種優選的實施方式，所述重組人促紅細胞生成素選自鼠卵巢細胞(cho)培養的重組人促紅細胞生成素或人胚胎腎細胞293(hek293)培養的重組人促紅細胞生成素。
8、作為一種優選的實施方式，所述生物素為生物素n-羥基琥珀酰亞胺酯(biotin-7-nhs)，所述生物素的濃度為3-7mg/ml，所述促紅細胞生成素抗體的濃度為1-3mg/ml，所述生物素與促紅細胞生成素抗體的質量比為(3-9)：1。
9、作為一種優選的實施方式，所述生物素為生物素n-羥基琥珀酰亞胺酯，所述生物素的濃度為5mg/ml，所述促紅細胞生成素抗體的濃度為1mg/ml，所述生物素與促紅細胞生成素抗體的質量比為6.6：1。
10、作為一種優選的實施方式，所述生物素與促紅細胞生成素抗體結合的條件為300-900rpm室溫避光孵育1-5h。
11、作為一種優選的實施方式，所述生物素與促紅細胞生成素抗體結合的條件為600rpm室溫避光孵育3h。
12、作為一種優選的實施方式，所述促紅細胞生成素抗體a為通過sephadex?g-25凝膠過濾小柱純化生物素修飾的抗體。
13、作為一種優選的實施方式，所述待測樣品經過pbs溶液稀釋，所述經過pbs溶液稀釋后的待測樣品與促紅細胞生成素抗體a的體積比為1：(1-3)，所述促紅細胞生成素抗體a的濃度為1-5μg/ml，所述待測樣品與促紅細胞生成素抗體a的共孵育溫度為1-5℃，共孵育時間為2-12h。
14、作為一種優選的實施方式，所述待測樣品經過pbs溶液稀釋，所述經過pbs溶液稀釋后的待測樣品與促紅細胞生成素抗體a的體積比為1：1，所述促紅細胞生成素抗體a的濃度為4μg/ml，所述待測樣品與促紅細胞生成素抗體a的共孵育溫度為4℃，共孵育時間為2-12h。
15、作為一種優選的實施方式，所述待測樣品與pbs溶液的體積比為1：(1-2)；優選的，所述待測樣品與pbs溶液的體積比為1：1。
16、作為一種優選的實施方式，所述待測樣品選自人血清、人血漿、人尿液中的一種，所述待測樣品的使用量為100-500μl。
17、作為一種優選的實施方式，所述待測樣品為血清或血漿。
18、作為一種優選的實施方式，將所述血清或血漿解凍后進行離心，所述離心溫度為2-8℃，選自2℃，3℃，4℃，5℃，6℃，7℃，8℃中的一種。
19、作為一種優選的實施方式，所述離心時間為10-30min，選自10min，12min，14min，15min，17min，18min，20min，22min，25min，27min，30min中的一種。
20、作為一種優選的實施方式，所述離心力為8000-22000g，選自8000g、10000g、12000g、14000g、16000g、18000g、20000g、22000g中的一種。
21、作為一種優選的實施方式，所述步驟s2的具體步驟包括：先使用pbs溶液配制的tween?20清洗鏈霉親和素包被的磁珠，然后用磁力架磁吸的方式分離磁珠，然后用pbs溶液再次清洗清洗鏈霉親和素包被的磁珠，然后與混合物1共孵育，然后洗脫液洗脫促紅細胞生成素，再次使用pbs溶液配制的tween?20清洗鏈霉親和素包被的磁珠，然后用磁力架磁吸的方式分離磁珠，最后用pbs溶液再次清洗清洗鏈霉親和素包被的磁珠。
22、作為一種優選的實施方式，所述pbs溶液配制的tween?20濃度為0.1-0.3wt％。
23、作為一種優選的實施方式，所述pbs溶液配制的tween?20濃度為0.1wt％。
24、作為一種優選的實施方式，所述鏈霉親和素包被的磁珠與促紅細胞生成素抗體a的體積比為1：(8-12)；所述步驟s2的共孵育條件為在35-40℃下800-1200rpm孵育1-3h。
25、作為一種優選的實施方式，所述鏈霉親和素包被的磁珠與促紅細胞生成素抗體a的體積比為1：10；所述步驟s2的共孵育條件為在37℃下900rpm孵育2h。
26、作為一種優選的實施方式，所述步驟s2中共孵育后，洗脫液洗脫促紅細胞生成素，所述洗脫液包括檸檬酸水溶液和乙腈，所述檸檬酸水溶液的濃度為0.01-0.03mol/l，所述檸檬酸水溶液和乙腈的體積比為(6-12)：1，洗脫條件為40-本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種人重組促紅細胞生成素來源的質譜鑒定方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述人重組促紅細胞生成素來源的質譜鑒定方法，其特征在于，所述促紅細胞生成素選自人內源促紅細胞生成素或重組人促紅細胞生成素，所述重組人促紅細胞生成素選自鼠卵巢細胞培養的重組人促紅細胞生成素或人胚胎腎細胞培養的重組人促紅細胞生成素。
3.根據權利要求1所述人重組促紅細胞生成素來源的質譜鑒定方法，其特征在于，所述生物素為生物素N-羥基琥珀酰亞胺酯，所述生物素的濃度為3-7mg/mL，所述促紅細胞生成素抗體的濃度為1-3mg/mL，所述生物素與促紅細胞生成素抗體的質量比為(3-9)：1。
4.根據權利要求1所述人重組促紅細胞生成素來源的質譜鑒定方法，其特征在于，所述生物素與促紅細胞生成素抗體結合的條件為300-900rpm室溫避光孵育1-5h。
5.根據權利要求1所述人重組促紅細胞生成素來源的質譜鑒定方法，其特征在于，所述待測樣品經過PBS溶液稀釋，所述經過PBS溶液稀釋后的待測樣品與促紅細胞生成素抗體A的體積比為1：(1-3)，所述促紅細胞生成素
6.根據權利要求1所述人重組促紅細胞生成素來源的質譜鑒定方法，其特征在于，所述待測樣品選自人血清、人血漿、人尿液中的一種，所述待測樣品的使用量為100-500μL。
7.根據權利要求1所述人重組促紅細胞生成素來源的質譜鑒定方法，其特征在于，所述步驟S2中共孵育后，洗脫液洗脫促紅細胞生成素，所述洗脫液包括檸檬酸水溶液和乙腈，所述檸檬酸水溶液的濃度為0.01-0.03mol/L，所述檸檬酸水溶液和乙腈的體積比為(6-12)：1，洗脫條件為40-50℃下500-1000rpm渦旋8-12min。
8.根據權利要求1所述人重組促紅細胞生成素來源的質譜鑒定方法，其特征在于，所述步驟S3中采用還原試劑和烷基化試劑進行還原烷基化反應，所述還原試劑的濃度為5-15mM，所述烷基化試劑的濃度為15-30mM，還原烷基化反應的溫度為50-60℃，反應時間為40-60min。
9.根據權利要求1所述人重組促紅細胞生成素來源的質譜鑒定方法，其特征在于，所述步驟S3中胰蛋白酶酶切前，加入20-30mM的碳酸氫胺水溶液20-40μL調整體系pH；所述胰蛋白酶的濃度為0.3-0.7μg/μL，胰蛋白酶使用量為2-4μL，所述胰蛋白酶的酶切條件為在35-40℃下500-1000rpm處理2-12h，然后用甲酸水溶液終止反應。
10.一種根據權利要求1-9任一項所述人重組促紅細胞生成素來源的質譜鑒定方法的應用，其特征在于，應用于促紅細胞生成素來源的鑒定中。
...【技術特征摘要】
1.一種人重組促紅細胞生成素來源的質譜鑒定方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述人重組促紅細胞生成素來源的質譜鑒定方法，其特征在于，所述促紅細胞生成素選自人內源促紅細胞生成素或重組人促紅細胞生成素，所述重組人促紅細胞生成素選自鼠卵巢細胞培養的重組人促紅細胞生成素或人胚胎腎細胞培養的重組人促紅細胞生成素。
3.根據權利要求1所述人重組促紅細胞生成素來源的質譜鑒定方法，其特征在于，所述生物素為生物素n-羥基琥珀酰亞胺酯，所述生物素的濃度為3-7mg/ml，所述促紅細胞生成素抗體的濃度為1-3mg/ml，所述生物素與促紅細胞生成素抗體的質量比為(3-9)：1。
4.根據權利要求1所述人重組促紅細胞生成素來源的質譜鑒定方法，其特征在于，所述生物素與促紅細胞生成素抗體結合的條件為300-900rpm室溫避光孵育1-5h。
5.根據權利要求1所述人重組促紅細胞生成素來源的質譜鑒定方法，其特征在于，所述待測樣品經過pbs溶液稀釋，所述經過pbs溶液稀釋后的待測樣品與促紅細胞生成素抗體a的體積比為1：(1-3)，所述促紅細胞生成素抗體a的濃度為1-5μg/ml，所述待測樣品與促紅細胞生成素抗體a的共孵育溫度為1-5℃，共孵育時間為2-12h。
6.根據權利要求1所述人重組促紅細胞生成素來源的質譜鑒定方法，其特征在于，所述待測樣...
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