【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物，特別涉及質粒系統及其應用。
技術介紹
1、重組腺相關病毒(recombinant?adeno-associated?virus，raav)可以在體內長期穩定表達外源基因，是一種低免疫原性病毒載體，所以成為基因治療領域中最有希望的遞送工具，被廣泛應用于基礎和臨床研究中，目前正在進行的臨床試驗就有幾百項，且已有六款aav基因治療藥物上市，商業前景十分廣闊。但是在2017年第一種aav基因治療藥物glybera宣布退市，究其原因是有價無市，其一次療法的費用高達100萬美元，生產成本高是其定價高的根本原因。所以實現規模化生產，得到高滴度高純度的raav載體一直是生物制藥企業需要解決的重大難題。
2、盡管aav在生物技術制品的相關評級中被認為安全性較高，但近年來，fda咨詢委員會對于aav臨床研究的結果也越發關注，在ind申請指南中對于復制型腺相關病毒(replication-competent?adeno-associated?virus，rcaav)的問題更是十分重視，他們建議檢測rcaav，且描述出檢測方法和檢測靈敏度。rcaav是指含有wtaav?rep和cap基因的有復制能力的病毒顆粒，當輔助病毒存在時，這種aav能夠進行復制。中國《體內基因治療產品藥學研究與評價技術指導原則(試行)》也明確指出，對于病毒載體類產品的起始原材料，比如瞬時轉染時用于病毒載體包裝的質粒，應全面考慮病毒載體設計，嚴格控制潛在風險。為了降低病毒生產和使用過程中重組產生可復制型或假野生型病毒的風險，建議優先選擇經驗證具有較高
3、由于復制蛋白rep具有解旋酶和內切酶活性，可能會誘發dna損傷引起細胞毒性，且衣殼蛋白cap也被發現會導致嚴重的細胞免疫反應，而rcaav就是這兩種蛋白的重要來源之一，因此會嚴重影響藥物安全性和質量。rcaav作為aav載體制劑中的一種雜質，在下游純化過程中是無法被區分去除的，rcaav殘留檢測也是法規要求的重點檢驗項目，所以必須降低rcaav含量。
4、現用生產raav的主要方式是aav無輔助病毒系統(aav?helper-free?system)，該系統包含三個質粒：第一個是含有目的基因(goi)的載體質粒，其兩端保留了aav的末端反向重復序列(inverted?terminal?repeat，itr)，是復制和包裝必需的順式作用元件；第二個是決定了血清型的rc質粒，編碼aav自身的復制蛋白rep和結構蛋白cap；最后需要一個輔助質粒phelper，提供從腺病毒ad(adenovirus)中分離的輔助基因e2a、e4?orf6和va?rna。通過三質粒瞬轉哺乳動物細胞，能夠快速、簡便生產出raav，但是此種方法生產用細胞多為貼壁細胞，需要胎牛血清培養，對生長條件和下游純化要求較嚴格，且需要制備大量高質量的質粒，因此生產成本很高，難以擴大。雖然目前已有商業化的懸浮hek293細胞，優點是使用無血清培養基進行培養，不僅可以減少下游純化步驟，還可以實現規模放大，缺點是受轉染復合物形成的動力學因素影響，轉染效率低，投料量相等的情況下，raav的產量不如貼壁培養高。另外由于所用包裝rc質粒的rep和cap基因在同一質粒骨架上，和wtaav基因序列排布基本相同，所以生產過程中載體質粒(paav-goi)的itr及其附近序列和包裝質粒(prc)的rep-cap序列之間極易于發生同源或非同源重組形成rcaav。目前已有多種抑制或避免包裝wtaav基因的方法，減少rcaav形成的第一種方法是：消除載體質粒和rc質粒之間的同源序列，進一步可以將rep和cap置于異源啟動子的控制下，代替aav的天然啟動子p5、p19或p40，甚至以相反的方向轉錄，有文獻報道通過這種方法可以將rcaav降低到檢測水平以下，缺點是raav產量可能大幅降低。另一種方法是通過在rep或cap基因內部插入內含子來產生超大的rc質粒，從而使得最終的序列超過aav的包裝限度，但此種方法在包裝過程中內含子很有可能被剪切掉，所以wtaav基因還是會被包裝進去，rcaav殘留量可能不符合臨床級aav載體制劑的監管要求。
5、由于存在以上產量和安全問題，所以提高產量降低raav載體的生產成本，盡量減少污染雜質rcaav造成的安全影響仍然是一個需要解決的技術問題。
技術實現思路
1、由于存在以上產量和安全問題，所以提高產量降低raav載體的生產成本，盡量減少污染雜質rcaav造成的安全影響十分必要。
2、本文的一方面，提供了一種輔助質粒，其特征在于，包含編碼cap基因的核酸序列和編碼至少一個用于腺相關病毒(aav)生產的輔助基因的核酸序列，所述cap基因編碼一個功能性的cap蛋白。
3、在一些實施例中，所述輔助質粒包含選自p5啟動子，p19啟動子，和p40啟動子的至少一個啟動子，且所述啟動子與所述cap基因可操作地連接。在一些實施例中，所述輔助質粒包含p5啟動子，p19啟動子，和p40啟動子；優選地，所述編碼cap基因的核酸序列包含，由5’端至3’端方向，編碼所述p5啟動子，所述p19啟動子，所述p40啟動子，和所述cap基因的序列。在一些實施例中，所述啟動子之間間隔不多于30bp，不多于25bp，不多于20bp，不多于15bp，不多于10bp，或不多于5bp的核苷酸。在一些實施例中，所述啟動子之間沒有間隔的核苷酸。在一些實施例中，所述啟動子和所述cap基因之間間隔不多于30bp，不多于25bp，不多于20bp，不多于15bp，不多于10bp，或不多于5bp的核苷酸。在一些實施例中，所述啟動子和所述cap基因之間沒有間隔的核苷酸。
4、在一些實施例中，所述p5啟動子的序列與seq?id?no:1第191-320位核苷酸有至少90％，至少95％，至少98％，至少99％，或100％的相同性。
5、在一些實施例中，所述p19啟動子的序列與seq?id?no:1第741-890位核苷酸有至少90％，至少95％，至少98％，至少99％，或100％的相同性。在一些實施例中，所述p19啟動子的序列在相對于seq?id?no:1第768位核苷酸的位置是t。
6、在一些實施例中，所述p40啟動子的序列與seq?id?no:1第1701-2202位核苷酸有至少90％，至少95％，至少98％，至少99％，或100％的相同性。在一些實施例中，所述p40啟動子的序列在相對于seq?id?no:1第1911-1912位核苷酸的位置是本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種輔助質粒，其特征在于，包含編碼Cap基因的核酸序列和編碼至少一個用于腺相關病毒(AAV)生產的輔助基因的核酸序列，所述Cap基因編碼一個功能性的Cap蛋白。
2.根據權利要求1所述的輔助質粒，其特征在于，包含選自P5啟動子，P19啟動子，和P40啟動子的至少一個啟動子，且所述啟動子與所述Cap基因可操作地連接。
3.根據權利要求2所述的輔助質粒，其特征在于，包含P5啟動子，P19啟動子，和P40啟動子；優選地，所述編碼Cap基因的核酸序列包含，由5’端至3’端方向，編碼所述P5啟動子，所述P19啟動子，所述P40啟動子，和所述Cap基因的序列。
4.根據權利要求2或3所述的輔助質粒，其特征在于，所述啟動子之間，和/或所述啟動子和所述Cap基因之間間隔不多于30bp，不多于25bp，不多于20bp，不多于15bp，不多于10bp，或不多于5bp的核苷酸；優選地，沒有間隔的核苷酸。
5.根據權利要求2-4任一項所述的輔助質粒，其特征在于，所述P5啟動子的序列與SEQID?NO:1第191-320位核苷酸有至少90％，至少95％，
6.根據權利要求2-5任一項所述的輔助質粒，其特征在于，所述P19啟動子的序列與SEQID?NO:1第741-890位核苷酸有至少90％，至少95％，至少98％，至少99％，或100％的相同性；優選地，所述P19啟動子的序列在相對于SEQ?ID?NO:1第768位核苷酸的位置是T。
7.根據權利要求2-6任一項所述的輔助質粒，其特征在于，所述P40啟動子的序列與SEQID?NO:1第1701-2202位核苷酸有至少90％，至少95％，至少98％，至少99％，或100％的相同性；優選地，所述P40啟動子的序列在相對于SEQ?ID?NO:1第1911-1912位核苷酸的位置是GT。
8.根據權利要求1-7任一項所述的輔助質粒，其特征在于，所述Cap基因的序列包含與SEQ?ID?NO:1第2203-4410位核苷酸有至少90％，至少95％，至少98％，至少99％，或100％的相同性的序列。
9.根據權利要求1-8任一項所述的輔助質粒，其特征在于，所述編碼Cap基因的核酸序列編碼一個polyA序列，所述polyA序列位于所述Cap基因下游。
10.根據權利要求9所述的輔助質粒，其特征在于，所述Cap基因與所述polyA序列之間間隔不多于30bp，不多于25bp，不多于20bp，不多于15bp，不多于10bp，或不多于5bp的核苷酸；優選地，沒有間隔的核苷酸。
11.根據權利要求9-10任一項所述的輔助質粒，其特征在于，所述polyA序列與SEQ?IDNO:1第4411-4460位核苷酸有至少90％，至少95％，至少98％，至少99％，或100％的相同性。
12.根據權利要求1-11任一項所述的輔助質粒，其特征在于，所述輔助質粒不能表達功能性的Rep蛋白。
13.根據權利要求1-12任一項所述的輔助質粒，其特征在于，所述輔助質粒不包含編碼Rep基因的核酸序列。
14.根據權利要求1-13任一項所述的輔助質粒，其特征在于，所述用于AAV生產的輔助基因包含選自E2A，E4，和VA?RNA的一個或多個基因。
15.根據權利要求14所述的輔助質粒，其特征在于，所述輔助基因包含E2A，E4，和VARNA。
16.一種質粒，其特征在于，包含編碼Rep基因的核酸序列，并且該質粒不能表達功能性的Cap蛋白。
17.根據權利要求16所述的質粒，其特征在于，所述質粒不包含編碼Cap基因的核酸序列。
18.根據權利要求16或17所述的質粒，其特征在于，所述質粒不能表達功能性的用于AAV生產的輔助基因的表達產物。
19.根據權利要求16-18任一項所述的質粒，其特征在于，所述質粒不包含編碼用于AAV生產的輔助基因的核酸序列。
20.根據權利要求16-19任一項所述的質粒，其特征在于，所述Rep基因表達Rep78，Rep68，Rep52，和Rep40蛋白。
21.根據權利要求20所述的質粒，其特征在于，所述Rep基因的序列包含與SEQ?ID?NO:1第321-2300位核苷酸有至少90％，至少95％，至少98％，至少99％，或100％的相同性的序列。
22.根據權利要求16-19任一項所述的質粒，其特征在于，所述Rep基因表達Rep78和Rep52蛋白；可選地，所述Rep基因不表達Rep68或Rep40蛋白。
23.根據權利...
【技術特征摘要】
1.一種輔助質粒，其特征在于，包含編碼cap基因的核酸序列和編碼至少一個用于腺相關病毒(aav)生產的輔助基因的核酸序列，所述cap基因編碼一個功能性的cap蛋白。
2.根據權利要求1所述的輔助質粒，其特征在于，包含選自p5啟動子，p19啟動子，和p40啟動子的至少一個啟動子，且所述啟動子與所述cap基因可操作地連接。
3.根據權利要求2所述的輔助質粒，其特征在于，包含p5啟動子，p19啟動子，和p40啟動子；優選地，所述編碼cap基因的核酸序列包含，由5’端至3’端方向，編碼所述p5啟動子，所述p19啟動子，所述p40啟動子，和所述cap基因的序列。
4.根據權利要求2或3所述的輔助質粒，其特征在于，所述啟動子之間，和/或所述啟動子和所述cap基因之間間隔不多于30bp，不多于25bp，不多于20bp，不多于15bp，不多于10bp，或不多于5bp的核苷酸；優選地，沒有間隔的核苷酸。
5.根據權利要求2-4任一項所述的輔助質粒，其特征在于，所述p5啟動子的序列與seqid?no:1第191-320位核苷酸有至少90％，至少95％，至少98％，至少99％，或100％的相同性。
6.根據權利要求2-5任一項所述的輔助質粒，其特征在于，所述p19啟動子的序列與seqid?no:1第741-890位核苷酸有至少90％，至少95％，至少98％，至少99％，或100％的相同性；優選地，所述p19啟動子的序列在相對于seq?id?no:1第768位核苷酸的位置是t。
7.根據權利要求2-6任一項所述的輔助質粒，其特征在于，所述p40啟動子的序列與seqid?no:1第1701-2202位核苷酸有至少90％，至少95％，至少98％，至少99％，或100％的相同性；優選地，所述p40啟動子的序列在相對于seq?id?no:1第1911-1912位核苷酸的位置是gt。
8.根據權利要求1-7任一項所述的輔助質粒，其特征在于，所述cap基因的序列包含與seq?id?no:1第2203-4410位核苷酸有至少90％，至少95％，至少98％，至少99％，或100％的相同性的序列。
9.根據權利要求1-8任一項所述的輔助質粒，其特征在于，所述編碼cap基因的核酸序列編碼一個polya序列，所述polya序列位于所述cap基因下游。
10.根據權利要求9所述的輔助質粒，其特征在于，所述cap基因與所述polya序列之間間隔不多于30bp，不多于25bp，不多于20bp，不多于15bp，不多于10bp，或不多于5bp的核苷酸；優選地，沒有間隔的核苷酸。
11.根據權利要求9-10任一項所述的輔助質粒，其特征在于，所述polya序列與seq?idno:1第4411-4460位核苷酸有至少90％，至少95％，至少98％，至少99％，或100％的相同性。
12.根據權利要求1-11任一項所述的輔助質粒，其特征在于，所述輔助質粒不能表達功能性的rep蛋白。
13.根據權利要求1-12任一項所述的輔助質粒，其特征在于，所述輔助質粒不包含編碼rep基因的核酸序列。
14.根據權利要求1-13任一項所述的輔助質粒，其特征在于，所述用于aav生產的輔助基因包含選自e2a，e4，和va?rna的一個或多個基因。
15.根據權利要求14所述的輔助質粒，其特征在于，所述輔助基因包含e2a，e4，和varna。
16.一種質粒，其特征在于，包含編碼rep基因的核酸序列，并且該質粒不能表達功能性的cap蛋白。
17.根據權利要求16所述的質粒，其特征在于，所述質粒不包含編碼cap基因的核酸序列。
18.根據權利要求16或17所述的質粒，其特征在于，所述質粒不能表達功能性的用于aav生產的輔助基因的表達產物。
19.根據權利要求16-18任一項所述的質粒，其特征在于，所述質粒不包含編碼用于aav生產的輔助基因的核酸序列。
20.根據權利要求16-19任一項所述的質粒，其特征在于，所述rep基因表達rep78，rep68，rep52，和rep40蛋白。
21.根據權利要求20所述的質粒，其特征在于，所述rep基因的序列包含與seq?id?no:1第321-2300位核苷酸有至少90％，至少95％，至少98％，至少99％，或100％的相同性的序列。
22.根據權利要求16-19任一項所述的質粒，其特征在于，所述rep基因表達rep78和rep52蛋白；可選地，所述rep基因不表達rep68或rep40蛋白。
23.根據權利要求22所述的質粒，其特征在于，所述rep基因的序列包含與seq?id?no:1第321-2196位核苷酸有至少90％，至少95％，至少98％，至少99％，或100％的相同性的序列。
24.根據權利要求16-23任一項所述的質粒，其特征在于，所述質粒包含一個位于所述rep基因的上游的p5啟動子和/或一個位于所述rep基因的下游的p5啟動子，所述p5啟動子與所述rep基因可操作地連接。
25.根據權利要求24所述的質粒，其特征在于，所述啟動子和所述rep基因之間間隔不多于30bp，不多于25bp，不多于20bp，不多于15bp，不多于10bp，或不多于5bp的核苷酸；優選地，沒有間隔的核苷酸。
26.根據權利要求24-25任一項所述的質粒，其特征在于，所述p5啟動子的序列與seqid?no:1第191-320位核苷酸，或與seq?id?no...
【專利技術屬性】
技術研發人員：肖溯，李斌，成傳剛，李孟悅，
申請(專利權)人：紐福斯蘇州生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：
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