【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于基因工程，具體涉及一種合成n-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌及其制備方法和應用，尤其涉及一種高效生產n-乙酰氨基葡萄糖的益生大腸桿菌基因工程菌的構建及應用。
技術介紹
1、n-乙酰氨基葡萄糖(n-acetyglucosamine，glcnac)是氨基葡萄糖(glucosamine，glcn)的乙酰化衍生物，是生物體內許多種功能多糖(如透明質酸、硫酸軟骨素等)的基本單位，廣泛存在于細菌、酵母、絲狀真菌、植物以及動物體內，在生物體的生命活動中發揮關鍵作用。glcnac對于骨關節的修復與保健，骨關節炎的治療具有重要的作用。另外，glcnac可以增強人體的免疫功能、可以作為食品添加劑、抗氧化劑以及糖尿病病人的甜味劑、還可以促進人體透明質酸的代謝合成，起到提升皮膚潤澤度的作用。因此，glcnac廣泛應用于醫藥、食品和化妝品等領域。
2、目前，glcnac的工業生產方法主要有酸水解法、酶水解法和微生物發酵法。酸水解法和酶水解法都是以從蝦蟹殼中提取的甲殼素為原料，再經酸解或酶解獲得glcnac。但酸水解法和酶水解法都存在很多問題，如甲殼素原料的來源受限、從蝦蟹中提取的甲殼素生產的glcnac易引起過敏反應；另外，酸水解法過程中會使用大量的強酸強堿，造成嚴重的環境污染；而酶水解法雖然反應條件溫和，但存在所需酶價格貴、酶解時間長、生產效率低等問題；因此，酸水解法和酶水解法均不適合未來綠色工業化生產。
3、近年來，隨著合成生物學技術的快速發展，生物合成glcnac的工業化體系已經建立起來。但目前工業化發酵生產glc
4、因此，尋找一種不含內毒素的大腸桿菌作為宿主菌，將極大地簡化產業化生產過程中目標產物的純化過程，并極大的提高目標產物的使用安全性。
技術實現思路
1、針對現有技術存在的不足，本專利技術的目的在于提供一種合成n-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌及其制備方法和應用。本專利技術克服了現有以e.coli為宿主進行glcnac生產過程中會產生細菌內毒素(lps)的不足，構建了以益生大腸桿菌nissle1917(escherichia?colinissle?1917，ecn)為宿主菌的高產glcnac的益生大腸桿菌基因工程菌，并對其進行基因改造，實現glcnac高效發酵合成，同時解決了產品的安全性問題，為實現其工業化大規模安全性生產glcnac提供了基礎。
2、本專利技術以益生菌大腸桿菌nissle?1917為宿主菌，其不含腸毒素、溶血毒素和細胞毒素等致病因子，對宿主無安全風險。
3、為達到此專利技術目的，本專利技術采用以下技術方案：
4、第一方面，本專利技術提供了一種合成n-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌，所述基因工程菌以大腸桿菌為初始菌，在初始菌的基因組上敲除了脫氨基酶基因nagb和脫乙酰基酶基因naga，并過表達氨基葡萄糖合成酶基因glms和氨基葡萄糖乙酰化酶基因gna1。
5、第二方面，本專利技術提供了一種合成n-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌，所述基因工程菌以大腸桿菌為初始菌，在初始菌的基因組上敲除了脫氨基酶基因nagb和脫乙酰基酶基因naga，進一步敲除甘露糖磷酸轉運子基因manx、乙酰氨基葡萄糖轉運子基因nage、乙酰氨基葡萄糖激酶基因nagk或葡萄糖跨膜轉運蛋白基因ptsg中的一個或多個，并過表達氨基葡萄糖合成酶基因glms和氨基葡萄糖乙酰化酶基因gna1。
6、優選地，當所述工程菌敲除葡萄糖跨膜轉運蛋白基因ptsg時，在過表達氨基葡萄糖合成酶基因glms和氨基葡萄糖乙酰化酶基因gna1的同時，過表達半乳糖協同轉運蛋白基因galp和葡萄糖激酶基因glk。
7、第三方面，本專利技術提供一種合成n-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌，所述基因工程菌以大腸桿菌為初始菌，在初始菌的基因組上敲除了脫氨基酶基因nagb和脫乙酰基酶基因naga、甘露糖磷酸轉運子基因manx、乙酰氨基葡萄糖轉運子基因nage、乙酰氨基葡萄糖激酶基因nagk，過表達氨基葡萄糖合成酶基因glms和氨基葡萄糖乙酰化酶基因gna1，并進一步過表達谷氨酰胺合成酶基因glna、果糖-1-磷酸磷酸酶基因yqab和乙酰氨基葡萄糖轉運基因icac中的一種或多種。
8、優選地，所述大腸桿菌選自bl21(de3)、或整合了t7?rna聚合酶表達框的nissle1917工程菌。
9、優選的，整合了t7?rna聚合酶表達框的nissle?1917工程菌的改造方法按照專利cn202310516515.6中所述的方法進行優化和改造而成。
10、優選地，所述整合了t7?rna聚合酶表達框的nissle?1917工程菌的遺傳改造包括：在nissle?1917的基因組上插入t7?rna聚合酶表達框，敲除基因組上的enda基因和ompt基因，敲除隱秘質粒pmut1和pmut2。
11、優選地，所述t7?rna聚合酶(t7rnap)表達框包括啟動子序列、操縱子序列、rbs序列、間隔序列以及位于rbs下游間隔序列下游的t7?rna聚合酶序列(gene?id:1261050)，其5’端如seq?id?no.19所示，改造和優化后的t7rnap表達框序列如seq?id?no.83所示。
12、優選地，所述過表達是將基因glms、gna1、glna、yqab、icac、galp或glk中的一個或多個整合到外源質粒上，并導入至工程菌中表達。
13、優選地，所述外源質粒選自petduet、pcoladuet、prsfduet或pcdfduet中任意一種或者至少兩種的組合。
14、優選地，所述敲除為采用crispr基因編輯方法或同源重組的方法進行基因敲除或沉默，從而下調或去除相關基因的功能。
15、優選地，所述氨基葡萄糖合成酶基因glms來源于：大腸桿菌k-12mg1655、枯草芽孢桿菌(bacillus?subtilis)、谷氨酸棒狀桿菌(corynebacterium?glutamate)；更優選來源于大腸桿菌k-12mg1655。
16、優選地，所述氨基葡萄糖乙酰化酶基因gna1來源于：釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)、秀麗隱桿線蟲(c.elegans)、或所述氨基葡萄糖乙酰化酶基因gna1為經大腸桿菌密碼子優化后的來源于釀酒酵母、秀麗隱桿線蟲的gna1；更優選，所述氨基葡萄糖乙酰化酶基因gna1為來源于釀酒酵母(saccharo本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種合成N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌以大腸桿菌為初始菌，在初始菌的基因組上敲除了脫氨基酶基因nagB和脫乙酰基酶基因nagA，并過表達氨基葡萄糖合成酶基因glmS和氨基葡萄糖乙酰化酶基因gna1。
2.一種合成N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌以大腸桿菌為初始菌，在初始菌的基因組上敲除了脫氨基酶基因nagB和脫乙酰基酶基因nagA，進一步敲除甘露糖磷酸轉運子基因manX、乙酰氨基葡萄糖轉運子基因nagE、乙酰氨基葡萄糖激酶基因nagK或葡萄糖跨膜轉運蛋白基因ptsG中的一個或多個，并過表達氨基葡萄糖合成酶基因glmS和氨基葡萄糖乙酰化酶基因gna1。
3.根據權利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，當所述工程菌敲除葡萄糖跨膜轉運蛋白基因ptsG時，在過表達氨基葡萄糖合成酶基因glmS和氨基葡萄糖乙酰化酶基因gna1的同時，過表達半乳糖協同轉運蛋白基因galP和葡萄糖激酶基因glk。
4.一種合成N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌以大腸桿菌為初始菌，在初始菌的基因組
5.根據權利要求1-4中任一項所述合成N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌，其特征在于，所述大腸桿菌選自BL21(DE3)、或整合了T7?RNA聚合酶表達框的Nissle?1917工程菌；
6.根據權利要求1-5中任一項所述的合成N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌，其特征在于，所述過表達是將基因glmS、gna1、glnA、yqaB、icaC、galP或glk中的一個或多個整合到外源質粒上，并導入至工程菌中表達；
7.權利要求1-6中任一項所述的合成N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌在生產N-乙酰氨基葡萄糖和/或氨基葡萄糖中的應用。
8.一種權利要求1-6中任一項所述的合成N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌的制備方法，其特征在于，制備方法包括：
9.根據權利要求8所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，所述N-乙酰氨基葡萄糖分解代謝的相關基因還包括：甘露糖磷酸轉運子基因manX、乙酰氨基葡萄糖轉運子基因nagE、乙酰氨基葡萄糖激酶基因nagK、葡萄糖跨膜轉運蛋白基因ptsG中的一個或多個；
10.根據權利要求8或9所述的制備方法，其特征在于，在初始菌中敲除了脫氨基酶基因nagB和脫乙酰基酶基因nagA、甘露糖磷酸轉運子基因manX、乙酰氨基葡萄糖轉運子基因nagE和乙酰氨基葡萄糖激酶基因nagK，過表達氨基葡萄糖合成酶基因glmS和氨基葡萄糖乙酰化酶基因gna1；
11.根據權利要求8-10中任一項所述的制備方法，其特征在于，所述整合了T7?RNA聚合酶表達框的Nissle?1917工程菌的遺傳改造包括：在Nissle?1917的基因組attB位點插入T7RNA聚合酶表達框，敲除基因組上的endA基因和ompT基因，敲除隱秘質粒pMUT1和pMUT2；
...【技術特征摘要】
1.一種合成n-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌以大腸桿菌為初始菌，在初始菌的基因組上敲除了脫氨基酶基因nagb和脫乙酰基酶基因naga，并過表達氨基葡萄糖合成酶基因glms和氨基葡萄糖乙酰化酶基因gna1。
2.一種合成n-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌以大腸桿菌為初始菌，在初始菌的基因組上敲除了脫氨基酶基因nagb和脫乙酰基酶基因naga，進一步敲除甘露糖磷酸轉運子基因manx、乙酰氨基葡萄糖轉運子基因nage、乙酰氨基葡萄糖激酶基因nagk或葡萄糖跨膜轉運蛋白基因ptsg中的一個或多個，并過表達氨基葡萄糖合成酶基因glms和氨基葡萄糖乙酰化酶基因gna1。
3.根據權利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，當所述工程菌敲除葡萄糖跨膜轉運蛋白基因ptsg時，在過表達氨基葡萄糖合成酶基因glms和氨基葡萄糖乙酰化酶基因gna1的同時，過表達半乳糖協同轉運蛋白基因galp和葡萄糖激酶基因glk。
4.一種合成n-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌以大腸桿菌為初始菌，在初始菌的基因組上敲除了脫氨基酶基因nagb和脫乙酰基酶基因naga、甘露糖磷酸轉運子基因manx、乙酰氨基葡萄糖轉運子基因nage、乙酰氨基葡萄糖激酶基因nagk，過表達氨基葡萄糖合成酶基因glms和氨基葡萄糖乙酰化酶基因gna1，并進一步過表達谷氨酰胺合成酶基因glna、果糖-1-磷酸磷酸酶基因yqab和乙酰氨基葡萄糖轉運基因icac中的一種或多種。
5.根據權利要求1-4中任一項所述合成n-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌，其特征在于，所述大腸桿...
【專利技術屬性】
技術研發人員：許本宏，袁珊，王晨舒，石雅南，迮曉雷，
申請(專利權)人：湯臣倍健股份有限公司，
類型：發明
國別省市：
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