【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及計算機數據處理，具體為一種手足口病病毒等溫擴增檢測方法。
技術介紹
1、手足口病(hand?foot?and?mouth?disease，hfmd)是由腸道病毒感染引起的一種兒童常見傳染病，5歲以下兒童多發。手足口病是全球性疾病，我國各地全年均有發生，發病率為37.01/10萬～205.06/10萬，近年報告病死率在6.46/10萬～51.00/10萬之間。腸道病毒屬于小rna病毒科腸道病毒屬。手足口病由腸道病毒引起，主要致病血清型包括柯薩奇病毒(coxsackievirus，cv)a組4～7、9、10、16型和b組1～3、5型，?？刹《?echovirus)的部分血清型和腸道病毒71型(enterovirus?a71，ev-a71，或ev?71)等，其中以cv-a16和ev-a71最為常見，重癥及死亡病例多由ev-a71所致。
2、公開號為cn114058735a的專利技術公開了一種基于crispr技術檢測手足口病的方法，包括利用grna、cas蛋白和單鏈核酸檢測器進行檢測的步驟，所述單鏈核酸檢測器可以為單鏈dna、單鏈rna或者單鏈dna-rna雜交體。
3、如上述專利技術所示，現有的手足口病等溫擴增結果檢測需要在價格昂貴的熒光定量pcr儀上進行，目前我國裝備有大型熒光定量pcr儀的實驗室及醫院有限，不能滿足口岸、基層和偏遠地區對于ev71病毒檢測的需求。
技術實現思路
1、針對現有技術的不足，本專利技術提供了一種手足口病病毒等溫擴增檢測方
2、為實現以上目的，本專利技術通過以下技術方案予以實現：一種手足口病病毒等溫擴增檢測方法，包括以下步驟：
3、步驟一：獲取待檢測人員的唾液，并從唾液樣本中抽取生物標志物；
4、步驟二：準備反應液存放容器，將等溫擴增緩沖液、提取的生物標志物、引物、反應酶置入容器內，在恒溫下制備等溫擴增反應液；
5、步驟三：對擴增產物進行同步檢測。
6、優選的，所述采集和處理參照衛生部《手足口病實驗室檢測方案》的方法。
7、優選的，所述樣本中rna病毒的抽提采用常規的trizol法。
8、優選的，所述引物包括正向引物和反向引物；
9、所述正向引物的堿基序列為seq?id?no.1：
10、acacaggtgagcagtcatcg；
11、所述的反向引物的堿基序列為seq?id?no.2：
12、aattctaatacgactcactatagggaagtctcaatcatgctctcatcact。
13、優選的，所述等溫擴增緩沖液包括tris?hcl40mm、kcl70mm、mgcl212mm、dtt10mm、dntp1mm、rntp2mm、山梨糖醇375mm。
14、優選的，所述反應酶由t7rna聚合酶、amv逆轉錄酶、rna酶h組成。
15、優選的，所述恒溫條件為恒溫水浴或熱塊擴增或任何保溫材料60℃～65℃，時間為15min～20min。
16、優選的，所述擴增產物的檢測方法包括：
17、方法1：取出反應容器，8000r/min離心15sec，觀察管底是否有白色沉淀產生；
18、方法2：取出反應容器，短暫離心后，加入1.5％的瓊脂糖凝膠電泳，通過凝膠成像系統觀察是否出現梯形條帶；
19、方法3：取出反應容器，冷卻至室溫，2000r/min離心15sec，加入熒光染料，輕輕混勻后進行觀察。
20、優選的，所述可檢測信號通過以下方式實現：基于視覺的檢測，基于傳感器的檢測，顏色檢測，基于金納米顆粒的檢測，熒光偏振，膠體相變/分散，電化學檢測和基于半導體的檢測
21、優選的，本專利技術的方法還包括測量crispr/cas效應蛋白(cas蛋白)產生的可檢測信號的步驟，所述cas蛋白識別所述靶核酸或與所述靶核酸雜交之后可以激發單鏈核酸的切割活性，從而切割所述單鏈核酸檢測器進而產生可檢測信號。
22、優選的，所述可檢測信號可以是當切割單鏈核酸檢測器時產生的任何信號，例如，基于金納米顆粒的檢測，熒光偏振，膠體相變/分散，電化學檢測，基于半導體的傳感，所述可檢測信號可通過任何合適的方式讀出，包括但不限于：可檢測的熒光信號的測量，凝膠電泳檢測(通過檢測凝膠上的條帶的變化)，基于視覺或傳感器的顏色的存在或不存在的檢測、或者顏色存在的差異(例如，基于金納米顆粒)以及電信號的差異。
23、優選的，所述可檢測信號通過以下方式實現：所述單鏈核酸檢測器的5’端和3’端分別設置不同的報告基團，當所述單鏈核酸檢測器被切割后，可以表現出可檢測的報告信號；例如，單鏈核酸檢測器的兩端分別設置熒光基團和淬滅基團，當所述單鏈核酸檢測器被切割后，可以表現出可檢測的熒光信號。
24、優選的，所述熒光基團選自fam、fitc、vic、joe、tet、cy3、cy5、rox、texas?red或lcred460中的一種或任意幾種；所述淬滅基團選自bhq1、bhq2、bhq3、dabcy1或tamra中的一種或任意幾種。
25、優選的，所述可檢測信號還可以通過以下方式實現：所述單鏈核酸檢測器的5’端和3’端分別設置不同的標記分子，通過膠體金檢測的方式檢測反應信號。
26、優選的，所述可檢測信號的測量可以是定量的，在其他的實施方式中，所述可檢測信號的測量可以是定性的。
27、優選的，環介導等溫擴增技術(lamp)是一種新的核酸等溫擴增技術，原理是在目的基因片段上的多個位點上設計4條或6條引物，通常只要4條引物即可完成目的基因的擴增，如果加入另外兩條環引物，可以有效的加速整個反應過程，但反應體系內引物的增多也會增加引物二聚體的形成。lamp反應結果判別方法多樣，目前常用的有電泳法、熒光法、濁度法和鈣黃綠素法。濁度法和鈣黃綠素法是基于lamp反應產生的大量焦磷酸鹽副產物進行檢測的方法，因此這2種方法均存在一定程度的背景干擾，且干擾強度隨反應時間延長而增加；電泳法和熒光法利用雙鏈嵌合染料直接檢測擴增產物，因此背景更低，其中熒光法的陽性、陰性可用肉眼區分，對操作人員的技術要求低，更適合于現場快速檢測。
28、有益效果
29、本專利技術提供了一種手足口病病毒等溫擴增檢測方法。與現有技術相比具備以下有益效果：
30、1、該手足口病病毒等溫擴增檢測方法，通過采用lamp技術，特異性強，且比pcr檢測方法有更高的靈敏度，是對目前核酸分子檢測技術手段的改進和補充，具有簡單、快速、高靈敏性高特異性的優勢。
31、2、該手足口病病毒等溫擴增檢測方法，通過針對手足口病毒特異性序列設計引物，與傳統培養法相比具有更高的特異性、靈敏度高、操作簡便、價格低廉，在滿足實時熒光檢測的同時，通過結合手持式熒光檢測儀，實現了對于nasba擴增結果的終點檢測，檢測靈敏度達到了熒光定量pcr水平。<本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種手足口病病毒等溫擴增檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的一種手足口病病毒等溫擴增檢測方法，其特征在于：所述采集和處理參照衛生部《手足口病實驗室檢測方案》的方法。
3.根據權利要求1所述的一種手足口病病毒等溫擴增檢測方法，其特征在于：所述樣本中生物標志物的抽提采用常規的Trizol法。
4.根據權利要求1所述的一種手足口病病毒等溫擴增檢測方法，其特征在于：所述引物包括正向引物和反向引物；
5.根據權利要求1所述的一種手足口病病毒等溫擴增檢測方法，其特征在于：所述等溫擴增緩沖液包括Tris?HCl40mM、KCl70mM、MgCl212mM、DTT10mM、dNTP1mM、rNTP2mM、山梨糖醇375mM。
6.根據權利要求1所述的一種手足口病病毒等溫擴增檢測方法，其特征在于：所述反應酶由T7RNA聚合酶、AMV逆轉錄酶、RNA酶H組成。
7.根據權利要求1所述的一種手足口病病毒等溫擴增檢測方法，其特征在于：所述恒溫條件為恒溫水浴或熱塊擴增或任何保溫材料60℃～65℃，時間為1
8.根據權利要求1所述的一種手足口病病毒等溫擴增檢測方法，其特征在于：所述擴增產物的檢測方法包括：
...【技術特征摘要】
1.一種手足口病病毒等溫擴增檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的一種手足口病病毒等溫擴增檢測方法，其特征在于：所述采集和處理參照衛生部《手足口病實驗室檢測方案》的方法。
3.根據權利要求1所述的一種手足口病病毒等溫擴增檢測方法，其特征在于：所述樣本中生物標志物的抽提采用常規的trizol法。
4.根據權利要求1所述的一種手足口病病毒等溫擴增檢測方法，其特征在于：所述引物包括正向引物和反向引物；
5.根據權利要求1所述的一種手足口病病毒等溫擴增檢測方法，其特征在于：所述等溫擴增緩沖液包括...
【專利技術屬性】
技術研發人員：王楊，李克蓉，閆翔宇，楊海君，稅鐵軍，何珺，
申請(專利權)人：昆明市延安醫院昆明市干部療養院，
類型：發明
國別省市：
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