【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于核酸檢測，具體涉及一種基于rt-lamp-crispr/cas12a技術的鴨坦布蘇病毒核酸熒光可視化檢測試劑盒及檢測方法。
技術介紹
1、鴨坦布蘇病毒（duck?tembusu?virus?,dtmuv）是黃病毒科（flaviviridae）黃病毒屬（flavivirus）的一種新發蚊媒病毒，其引起的疫病在臨床上以蛋鴨產蛋量下降和雛鴨神經系統損傷為特征。1955年，研究人員首次在三帶喙庫蚊體內發現坦布蘇病毒，直到2000年，在馬來西亞發現了由坦布蘇病毒感染導致的雛雞腦炎和生長遲緩的病例。2010年，dtmuv在我國上海等地的蛋種鴨中首次暴發，給國內養鴨業造成了重大的經濟損失。目前，dtmuv的感染宿主已擴大至肉鴨、番鴨、鵝、蛋雞、鴿子、麻雀等多種禽類；dtmuv傳播途徑多樣，該病毒在禽類群體中可以通過直接接觸或氣溶膠傳播，甚至垂直傳播，嚴重威脅養禽業的健康發展。
2、自鴨坦布蘇病毒病暴發以來，我國陸續研制了dtmuv弱毒疫苗、滅活疫苗等多種疫苗，商業化疫苗的投入和使用使得該病的流行強度由暴發逐漸轉變為零星散發。為了更好的預防鴨坦布蘇病毒病，國內已建立了多種用于dtmuv臨床診斷或實驗室檢測方法。其中，用于dtmuv的實驗室檢測方法主要包括病毒的分離與鑒定、血清學檢測和分子生物學技術等。病毒的分離與鑒定法是檢測病毒性傳染病的“金標準”，也是檢驗dtmuv的經典方法，可以準確獲得病毒的主要信息，如其基因型、是否變異等。但由于病毒載量低、分離困難、工作量大、試驗條件要求高、檢測時間長且成功率不高等因素，該方法
3、核酸的快速檢測在疫病早期診斷與生物技術應用等方面都占據了舉足輕重的位置，被廣泛應用于公共衛生行業、畜禽養殖業與進出口檢疫等領域。隨著科學技術的蓬勃發展，crispr核酸檢測技術逐漸代替了原有的需通過擴增核酸的檢測技術，具有特異性強、靈敏度高、節約時間和節省成本的顯著優點。例如使用率最高的pcr或rt-pcr，與crispr檢測技術相比，它們對于實驗器材和實驗人員的要求較高，很難實現畜牧養殖地疫病發生初期的現場檢測，即即時檢測(poct)。
技術實現思路
1、本專利技術的目的在于提供基于rt-lamp-crispr/cas12a技術的鴨坦布蘇病毒核酸熒光可視化檢測試劑盒及檢測方法，利用rt-lamp技術結合crispr-cas12a檢測，通過熒光可視化檢測的熒光報告基因，開發了一種能在藍光切膠儀下、快速、靈敏、高特異、檢測鴨坦布蘇病毒核酸的檢測試劑盒及檢測方法。
2、為達到上述目的，本專利技術采用如下技術方案：
3、一種基于rt-lamp和crispr/cas12a技術的鴨坦布蘇病毒核酸檢測試劑盒，所述試劑盒包括用于鴨坦布蘇病毒核酸檢測的rt-lamp擴增體系和crispr/cas12a檢測體系；
4、所述rt-lamp擴增體系包括針對鴨坦布蘇病毒的rt-lamp引物組；所述引物組的核苷酸序列如seq?id?no:14~seq?id?no:19所示；
5、所述crispr/cas12a檢測體系包括針對鴨坦布蘇病毒的特異性crrna、cas12蛋白和單鏈dna報告分子；
6、所述針對鴨坦布蘇病毒核酸的特異性crrna的核苷酸序列如seq?id?no:9、seq?idno:10或seq?id?no:13所示；
7、所述單鏈dna報告分子為rox-gtatccagtgcg-bhq2。
8、進一步地，所述crrna的核苷酸序列如seq?id?no:10所示。
9、上述的試劑盒在檢測鴨坦布蘇病毒核酸產品中的應用。
10、一種檢測鴨坦布蘇病毒核酸的方法，包括以下步驟：
11、（1）制備鴨坦布蘇病毒核酸模板；
12、（2）以步驟（1）提取的核酸為模板，引入rt-lamp引物組在65℃、40min的反應條件下于恒溫金屬浴中擴增得到擴增產物；所述擴增體系為25μl，包括1μl?8u?bst?ii?dna大片段聚合酶、2.5μl?10×等溫擴增緩沖液、6mm?mgso4、1.4mm?dntp?mix，以無核酸酶的水補充至25μl；
13、（3）將步驟（2）得到的擴增體系進行cas12a酶切反應，反應體系為1μm?crrna、2μllamp擴增產物、0.5μm的cas12a、20μm的單鏈dna報告分子rox-gtatccagtgcg-bhq2、2μl的10×?cutsmart?buffer、以無核酸酶的水補足至20?μl；
14、（4）將反應產物移至藍光切膠儀通過觀察熒光鑒定檢測結果，當反應產物出現橙色熒光即為陽性，當反應產物未出現任何熒光即為陰性。
15、本專利技術的有益效果為：
16、1、本專利技術提供了一種基于crispr-cas12a系統聯合反轉錄環介導等溫擴增?(rt-lamp)?介導的鴨坦布蘇病毒核酸檢測試劑盒及檢測方法，該檢測試劑盒的rt-lamp引物組和crrna具有高靈敏度和高特異性。
17、2、本專利技術的檢測方法與rt-qpcr和rt-pcr方法對鴨坦布蘇病毒檢測結果的陽性符合率與陰性符合率均為100%，本專利技術操作方法簡便，無需昂貴設備，能實現低成本、現場快捷檢測，可廣泛應用于各大養殖企業，提高養殖業經濟效益、為早期診斷提供便利。
本文檔來自技高網...【技術保護點】
1.一種基于RT-LAMP和CRISPR/Cas12a技術的鴨坦布蘇病毒核酸檢測試劑盒，其特征在于：所述試劑盒包括用于鴨坦布蘇病毒核酸檢測的RT-LAMP擴增體系和CRISPR/Cas12a檢測體系；
2.根據權利要求1所述的鴨坦布蘇病毒核酸檢測試劑盒，其特征在于：所述crRNA的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:10所示。
3.如權利要求1所述的試劑盒在檢測鴨坦布蘇病毒核酸產品中的應用。
4.一種利用權利要求1所述的試劑盒檢測鴨坦布蘇病毒核酸的方法，其特征在于，包括以下步驟：
【技術特征摘要】
1.一種基于rt-lamp和crispr/cas12a技術的鴨坦布蘇病毒核酸檢測試劑盒，其特征在于：所述試劑盒包括用于鴨坦布蘇病毒核酸檢測的rt-lamp擴增體系和crispr/cas12a檢測體系；
2.根據權利要求1所述的鴨坦布蘇病毒核酸檢測...
【專利技術屬性】
技術研發人員：林瑞意，林威敏，陳吉敏，謝勝松，陶大剛，李輝煌，
申請(專利權)人：福建農林大學，
類型：發明
國別省市：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。