【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本申請涉及微生物，尤其是一種快速鑒定嗜鹽四聯(lián)球菌的篩選方法及其應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、嗜鹽四聯(lián)球菌是一類廣泛存在于醬油，魚露等發(fā)酵產(chǎn)品中具有耐鹽，耐高滲透壓特性的中度耐鹽乳酸菌，其能夠有效提高發(fā)酵產(chǎn)品質(zhì)量并縮短發(fā)酵周期，是一種重要的發(fā)酵菌株。已有研究表明嗜鹽四聯(lián)球菌可以提高發(fā)酵產(chǎn)品中有機酸、醛類、酯類、氨基酸等多種風味物質(zhì)的含量，給醬油，魚露等調(diào)味料提供了柔和豐富的滋味。
2、然而，嗜鹽四聯(lián)球菌的某些菌株會降解特定的氨基酸，如組氨酸、酪氨酸、精氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸等，氨基酸降解會導(dǎo)致醬油氨基酸指標的減低，從而對醬油的風味口感帶來不利影響。盡管這些氨基酸的降解途徑尚未完全闡明，但其中一些通過脫羧反應(yīng)變成了脫羧物質(zhì)。醬醪的天然發(fā)酵環(huán)境中含有豐富的乳酸菌組成，既有產(chǎn)生優(yōu)良性狀的菌株也有帶來不良代謝物的菌株，因其菌株代謝的不確定性對醬油等發(fā)酵產(chǎn)品性能的穩(wěn)定性造成了影響。而在醬醪體系中人工干預(yù)強化具有優(yōu)良性狀的菌株為嗜鹽四聯(lián)球菌，能夠抑制不良菌株的生長進而減少不良代謝物的產(chǎn)生。為了獲得具有穩(wěn)定優(yōu)良特性的發(fā)酵產(chǎn)品，防止氨基酸降解等不良代謝物的積累，強化不能代謝氨基酸等的嗜鹽四聯(lián)球菌菌株正在被推廣。
3、因此，迫切需要篩選具有優(yōu)良性狀的工業(yè)用嗜鹽四聯(lián)球菌菌株。在對篩選所得菌種進行種屬鑒定的方法中最常用的是基因型鑒定，即通過微生物高度保守的核酸序列來進行分離和鑒定，包括細菌的16s?rrna基因序列分析和真菌的18s?rrna基因序列分析以及its區(qū)域序列分析等。基因型鑒定是通過特異性引物對擴增高度保守的核酸序列
4、目前大多數(shù)醬油公司采用自然發(fā)酵模式，整個發(fā)酵體系處于敞開狀態(tài)，依靠天然曬露，不添加菌種，依靠自然環(huán)境中的微生物參與發(fā)酵。曲霉菌、酵母菌、乳酸菌等多種微生物的參與促進了更多風味物質(zhì)的形成，使醬油風味更加獨特，但復(fù)雜的微生物體系也導(dǎo)致了發(fā)酵產(chǎn)品質(zhì)量不夠穩(wěn)定。日式醬油工藝雖起源于中式醬油工藝，但對中式傳統(tǒng)的自然發(fā)酵工藝進行了控溫發(fā)酵的改進，采用了大型密閉發(fā)酵罐發(fā)酵、鹽水冷卻成曲、人工強化功能酵母和嗜鹽乳酸菌、定期通氣攪拌等技術(shù)，使產(chǎn)品的性能和穩(wěn)定性得到了提高。然而針對具有優(yōu)良特性嗜鹽乳酸菌的分離鑒定和篩選方面，傳統(tǒng)的菌種鑒定方法特異性不強，帶來龐大的測序檢測量，相對耗時耗力，檢測效率較低。
5、為了解決傳統(tǒng)發(fā)酵食品性能和質(zhì)量不穩(wěn)定性的問題，需要一種高效篩選具有優(yōu)良性狀的嗜鹽四聯(lián)球菌菌株的方法。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本申請的目的在于，克服傳統(tǒng)發(fā)酵食品性能和質(zhì)量不穩(wěn)定性的問題，提供了一種快速鑒定嗜鹽四聯(lián)球菌的篩選方法及其應(yīng)用，本申請的篩選方法簡單、高效且準確性強。
2、為實現(xiàn)上述目的，本申請采用如下技術(shù)方案：
3、本申請?zhí)峁┝撕Y選或輔助篩選不生產(chǎn)生物胺的嗜鹽四聯(lián)球菌的引物組，所述引物組包括針對嗜鹽四聯(lián)球菌16s?rdna的特異性引物1、針對組氨酸脫羧酶基因的特異性引物2和針對酪胺脫羧酶基因的特異性引物3；
4、所述特異性引物1的核苷酸序列如seq?no：1～2所示；
5、所述特異性引物2的核苷酸序列如seq?no：3～4所示；
6、所述特異性引物3的核苷酸序列如seq?no：5～6所示。
7、在本申請的技術(shù)方案中，對嗜鹽四聯(lián)球菌核酸序列比對分析發(fā)現(xiàn)其16srdna上有一段高度保守的特異性區(qū)域，通過設(shè)計特異性引物1(分別為p1、p2，核苷酸序列分別如seqno：1～2)進行pcr擴增，能夠快速、準確的篩選出嗜鹽四聯(lián)球菌。
8、由于氨基酸代謝物組胺和酪胺生成型嗜鹽四聯(lián)球菌通常會攜帶組氨酸脫羧酶基因和酪胺脫羧酶基因，本申請通過設(shè)計針對組氨酸脫羧酶基因的特異性引物2(分別為p3、p4，核苷酸序列分別如seq?no：3～4)和酪胺脫羧酶基因的特異性引物3(分別為p5、p6，核苷酸序列分別如seq?no：5～6)通過pcr擴增，簡單且高效篩選不生產(chǎn)組胺和酪胺等生物胺的優(yōu)良嗜鹽四聯(lián)球菌。
9、優(yōu)選地，所述生物胺包括組胺或酪胺。
10、本申請?zhí)峁┝撕Y選或輔助篩選嗜鹽四聯(lián)球菌的試劑或試劑盒，所述試劑或試劑盒包括上述引物組。
11、采用含有上述引物組的試劑或試劑盒，可以快速、準確的篩選鑒定出嗜鹽四聯(lián)球菌，并且可以高效篩選出不生產(chǎn)組胺和酪胺等生物胺的優(yōu)良嗜鹽四聯(lián)球菌。
12、優(yōu)選地，所述試劑盒還包括pcr反應(yīng)液。
13、所述試劑盒還包括高保真taq酶預(yù)混液。
14、本申請?zhí)峁┝艘环N篩選或輔助篩選不生產(chǎn)生物胺的嗜鹽四聯(lián)球菌的方法，所述方法包括以下步驟：
15、1)提取待測樣品dna；
16、2)以所述待測樣品dna為模板，用上述引物組進行pcr擴增，鑒定篩選挑取的單克隆菌落，得到不生產(chǎn)生物胺的嗜鹽四聯(lián)球菌。
17、本申請的篩選方法首先基于嗜鹽四聯(lián)球菌的16s?rdna設(shè)計出特異性引物1，通過pcr擴增可同時實現(xiàn)對嗜鹽四聯(lián)球菌菌株的快速鑒定和對不具有代謝氨基酸性能菌株的快速篩選；并且，進一步設(shè)計針對組氨酸脫羧酶基因的特異性引物2和針對酪胺脫羧酶基因的特異性引物3，通過pcr擴增高效篩選不生產(chǎn)組胺和酪胺等生物胺的優(yōu)良嗜鹽四聯(lián)球菌。
18、本申請使用pcr擴增的方式實現(xiàn)對嗜鹽四聯(lián)球菌的特異性篩選鑒定，無需對菌株進行基因組提取和上機測序，提升了篩選的效率，降低了篩選成本；基于對生物胺生成關(guān)鍵酶的特異性基因擴增進行不產(chǎn)生物胺菌株的篩選，進一步提升了篩選效率，實現(xiàn)了對工業(yè)優(yōu)良性狀嗜鹽四聯(lián)球菌菌株的高效篩選。
19、采用本申請的方法可以同時進行嗜鹽四聯(lián)球菌的鑒定和不產(chǎn)生組胺、酪胺的嗜鹽四聯(lián)球菌的篩選，并實現(xiàn)了高通量檢測，有效降低了基因提取、測序的人工成本和時間成本。
20、優(yōu)選地，所述步驟1)包括：取醬醪樣品重懸于無菌水中，得到混合菌液，將混合菌液稀釋后，涂布于固體平板上，進行厭氧培養(yǎng)，挑取有透明圈的單克隆菌落，分離純化，然后將分離純化后的單克隆菌落重懸于無菌水中，水浴處理，得到待測樣品dna。
21、更優(yōu)選地，所述固體平板為含0.5％碳酸鈣的mrs加鹽(5％-10％)固體平板。
22、更優(yōu)選地，所述水浴處理的溫度為95～98℃，水浴處理時間為10～15min。
23、優(yōu)選地，所述步驟2)中，pcr擴增反應(yīng)程序為：98℃變性30s，60℃退火20s，72℃延伸30s，30個循環(huán)。<本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
1.篩選或輔助篩選不生產(chǎn)生物胺的嗜鹽四聯(lián)球菌的引物組，其特征在于，所述引物組包括針對嗜鹽四聯(lián)球菌16S?rDNA的特異性引物1、針對組氨酸脫羧酶基因的特異性引物2和針對酪胺脫羧酶基因的特異性引物3；
2.篩選或輔助篩選嗜鹽四聯(lián)球菌的試劑或試劑盒，其特征在于，所述試劑或試劑盒包括如權(quán)利要求1所述的引物組。
3.如權(quán)利要求2所述的試劑或試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括PCR反應(yīng)液。
4.一種篩選或輔助篩選不生產(chǎn)生物胺的嗜鹽四聯(lián)球菌的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述步驟1)包括：取醬醪樣品重懸于無菌水中，得到混合菌液，將混合菌液稀釋后，涂布于固體平板上，進行厭氧培養(yǎng)，挑取有透明圈的單克隆菌落，分離純化，然后將分離純化后的單克隆菌落重懸于無菌水中，水浴處理，得到待測樣品DNA。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述步驟2)中，PCR擴增反應(yīng)程序為：98℃變性30s，60℃退火20s，72℃延伸30s，30個循環(huán)。
7.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于
8.如權(quán)利要求4～7任一項所述的方法在發(fā)酵食品中的應(yīng)用。
9.如權(quán)利要求1所述的引物組或者如權(quán)利要求2或3所述的試劑或試劑盒在篩選或輔助篩選嗜鹽四聯(lián)球菌中的應(yīng)用。
10.如權(quán)利要求1所述的引物組在制備篩選或者輔助篩選嗜鹽四聯(lián)球菌的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
...【技術(shù)特征摘要】
1.篩選或輔助篩選不生產(chǎn)生物胺的嗜鹽四聯(lián)球菌的引物組，其特征在于，所述引物組包括針對嗜鹽四聯(lián)球菌16s?rdna的特異性引物1、針對組氨酸脫羧酶基因的特異性引物2和針對酪胺脫羧酶基因的特異性引物3；
2.篩選或輔助篩選嗜鹽四聯(lián)球菌的試劑或試劑盒，其特征在于，所述試劑或試劑盒包括如權(quán)利要求1所述的引物組。
3.如權(quán)利要求2所述的試劑或試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括pcr反應(yīng)液。
4.一種篩選或輔助篩選不生產(chǎn)生物胺的嗜鹽四聯(lián)球菌的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述步驟1)包括：取醬醪樣品重懸于無菌水中，得到混合菌液，將混合菌液稀釋后，涂布于固體平板上，進行厭氧培養(yǎng)，挑取有透明圈的單克隆菌落，分離純化，然后將分離純化后的單克隆菌落重懸于無菌水中，水浴處理，得到待測樣品dna...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：陳晨，吳日幫，孫艷萍，周斌，周其洋，
申請(專利權(quán))人：佛山市海天高明調(diào)味食品有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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