【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于生物醫(yī)藥和細(xì)胞工程，具體涉及表皮類器官細(xì)菌感染模型的構(gòu)建，以及針對該模型的藥物篩選平臺的搭建。
技術(shù)介紹
1、皮膚是哺乳動物體內(nèi)最大的器官之一。它的主要功能包括防止液體和電解質(zhì)流失以及物理，化學(xué)和生物傷害。皮膚和軟組織感染(skin?and?soft-tissue?infections,ssti)是住院患者發(fā)病率和死亡率的重要原因，也是臨床醫(yī)生面臨的主要治療挑戰(zhàn)。
2、早期診斷、選擇合適的抗菌藥物和及時的手術(shù)干預(yù)是成功治療的關(guān)鍵。因此亟需構(gòu)建適宜的高通量抗菌藥物篩選模型。在過去的幾十年里，2d(two-dimensional,2d)原代表皮細(xì)胞被作為抗菌藥物篩選的寶貴工具，然而以2d形式擴(kuò)張的表皮細(xì)胞不能概括人體表皮的體內(nèi)細(xì)胞組成和生理結(jié)構(gòu)，抗菌藥物篩選結(jié)果與體內(nèi)相差甚遠(yuǎn)。隨后氣液培養(yǎng)方法重構(gòu)下的多層表皮為皮膚感染藥物預(yù)測提供了3d(three-dimensional,3d)皮膚模型，然而該模型重建的表皮壽命有限，建模周期長且成功率低，限制其在高通量篩選藥物方向的大規(guī)模應(yīng)用。此外，小鼠及其它哺乳動物造模是經(jīng)典的抗菌藥物篩選模型，但造模周期長，成本高，限制其精準(zhǔn)性及高通量性。
3、類器官是體外三維環(huán)境中生長形成的細(xì)胞小簇，由干細(xì)胞衍生并自組織分化為功能性細(xì)胞類型，從而概括了體內(nèi)器官的結(jié)構(gòu)和功能。類器官概況主要組織的三維結(jié)構(gòu)，異質(zhì)性和細(xì)胞功能，在建模人類疾病和預(yù)測藥物反應(yīng)方面更具生理相關(guān)性，因此可作為細(xì)胞系和體內(nèi)模型間的紐帶。此外，類器官可在體外大量擴(kuò)增，并可以和普通細(xì)胞一樣進(jìn)行凍存。同時類器官
4、基于類器官模型的特征，本專利技術(shù)首次利用表皮類器官構(gòu)建細(xì)菌感染模型，并提出針對該模型的適宜的藥物篩選方式。該模型可用于抗菌藥物的高通量篩選以及藥物靶點的開發(fā)，還可用于疾病致病機(jī)理和藥物防御機(jī)理的研究，具有重要的社會、經(jīng)濟(jì)和科學(xué)意義。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、有鑒于此，本專利技術(shù)旨在提供一種基于感染表皮類器官模型的藥物抗菌評價方法以獲得更準(zhǔn)確的藥物篩選數(shù)據(jù)。為感染患者的臨床治療提供了新的策略。
2、在本專利技術(shù)的第一方面，提供了一種非診斷非治療的基于類器官細(xì)菌感染模型的藥物篩選方法，包括步驟：
3、(i)將3d類器官從基質(zhì)膠中釋放并進(jìn)行消化處理，從而獲得來自3d類器官的細(xì)胞；
4、(ii)所述的來自3d類器官的細(xì)胞計數(shù)，并取預(yù)定數(shù)量的來自3d類器官的細(xì)胞與細(xì)菌進(jìn)行混合，并共孵育，得到第一共孵育混合物；其中，所述混合共孵育包括實驗組和陰性對照組；其中，所述實驗組在待測藥物存在下孵育，而陰性對照組在沒有待測藥物存在下孵育，其余條件與實驗組相同；
5、(iii)測定實驗組的細(xì)胞活力a1與陰性對照組細(xì)胞活力a0，并進(jìn)行比較，其中，如果陰性對照組細(xì)胞活力a0顯著低于所述細(xì)胞活力a1，則提示所述的待測藥物為對所述細(xì)菌有抑制作用的抗菌劑。
6、在另一優(yōu)選例中，所述的顯著低于指a0/a1≤0.75，較佳地a0/a1≤0.5，更佳地a0/a1≤0.25或≤1/5。
7、在部分實施方式中，步驟(i)中所述的3d類器官是新鮮獲得的3d培養(yǎng)的類器官。
8、在另一優(yōu)選例中，所述的3d類器官選自下組：人類器官、鼠類器官、狗類器官、猿猴類器官。
9、在另一優(yōu)選例中，所述的3d類器官為皮膚類器官，所述的皮膚類器官包括上皮類器官。
10、在部分實施方式中，步驟(ii)中所述的細(xì)菌感染液是將細(xì)菌用類器官培養(yǎng)基稀釋后所獲得的溶液，所述的細(xì)菌選自下組：金黃色葡萄球菌，大腸桿菌，綠膿桿菌；所述的細(xì)菌可以是抗菌的或非抗菌的。
11、在部分實施方式中，步驟(i)中所述的將3d類器官從基質(zhì)膠中釋放是指通過酶解破壞基質(zhì)膠成分，但不破壞類器官的3d結(jié)構(gòu)，獲得懸浮在培養(yǎng)基中的類器官混懸液。
12、在另一優(yōu)選例中，所述的酶解使用分散酶，濃度為0.5-2u/ml，消化條件為35-40℃，0.5-2h。優(yōu)選地，所述的分散酶為tryple。
13、在部分實施方式中，步驟(ii)中，混合共孵育還包括陽性對照組；所述的陽性對照組在已知藥物存在下孵育，其余條件與實驗組和陰性對照組相同。
14、在本專利技術(shù)的第二方面，提供了一種非診斷非治療的類器官細(xì)菌感染模型的構(gòu)建方法，包括步驟：
15、(i)將3d類器官從基質(zhì)膠中釋放并進(jìn)行消化處理，從而獲得來自3d類器官的細(xì)胞；
16、(ii)所述的來自3d類器官的細(xì)胞計數(shù)，并取預(yù)定數(shù)量的來自3d類器官的細(xì)胞與細(xì)菌進(jìn)行混合，并共孵育，得到第一共孵育混合物；其中，所述混合共孵育包括實驗組和陰性對照組；其中，所述實驗組在待測藥物存在下孵育，而陰性對照組在沒有待測藥物存在下孵育，其余條件與實驗組相同。
17、在部分實施方式中，步驟(i)中所述的3d類器官是新鮮獲得的3d培養(yǎng)的類器官。
18、在另一優(yōu)選例中，所述的3d類器官選自下組：人類器官、鼠類器官、狗類器官、猿猴類器官。
19、在另一優(yōu)選例中，所述的3d類器官為皮膚類器官，所述的皮膚類器官包括上皮類器官。
20、在部分實施方式中，步驟(ii)中所述的細(xì)菌感染液是將細(xì)菌用類器官培養(yǎng)基稀釋后所獲得的溶液，所述的細(xì)菌選自下組：金黃色葡萄球菌，大腸桿菌，綠膿桿菌；所述的細(xì)菌可以是抗菌的或非抗菌的。
21、在部分實施方式中，所述的將3d類器官從基質(zhì)膠中釋放是指通過酶解破壞基質(zhì)膠成分，但不破壞類器官的3d結(jié)構(gòu)，獲得懸浮在培養(yǎng)基中的類器官混懸液。
22、在另一優(yōu)選例中，所述的酶解使用分散酶，濃度為0.5-2u/ml，消化條件為35-40℃，0.5-2h。優(yōu)選地，所述的分散酶為tryple。
23、在部分實施方式中，步驟(ii)中，混合共孵育還包括陽性對照組；所述的陽性對照組在已知藥物存在下孵育，其余條件與實驗組和陰性對照組相同。
24、應(yīng)理解，在本專利技術(shù)范圍內(nèi)中，本專利技術(shù)的上述各技術(shù)特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
本文檔來自技高網(wǎng)...【技術(shù)保護(hù)點】
1.一種非診斷非治療的基于類器官細(xì)菌感染模型的藥物篩選方法，包括步驟：
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(I)中所述的3D類器官是新鮮獲得的3D培養(yǎng)的類器官。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(II)中所述的細(xì)菌感染液是將細(xì)菌用類器官培養(yǎng)基稀釋后所獲得的溶液，所述的細(xì)菌選自下組：金黃色葡萄球菌，大腸桿菌，綠膿桿菌；所述的細(xì)菌可以是抗菌的或非抗菌的。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(I)中所述的將3D類器官從基質(zhì)膠中釋放是指通過酶解破壞基質(zhì)膠成分，但不破壞類器官的3D結(jié)構(gòu)，獲得懸浮在培養(yǎng)基中的類器官混懸液。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(II)中，混合共孵育還包括陽性對照組；所述的陽性對照組在已知藥物存在下孵育，其余條件與實驗組和陰性對照組相同。
6.一種非診斷非治療的類器官細(xì)菌感染模型的構(gòu)建方法，包括步驟：
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(I)中所述的3D類器官是新鮮獲得的3D培養(yǎng)的類器官。
8.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于
9.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述的將3D類器官從基質(zhì)膠中釋放是指通過酶解破壞基質(zhì)膠成分，但不破壞類器官的3D結(jié)構(gòu)，獲得懸浮在培養(yǎng)基中的類器官混懸液。
10.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(II)中，混合共孵育還包括陽性對照組；所述的陽性對照組在已知藥物存在下孵育，其余條件與實驗組和陰性對照組相同。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種非診斷非治療的基于類器官細(xì)菌感染模型的藥物篩選方法，包括步驟：
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(i)中所述的3d類器官是新鮮獲得的3d培養(yǎng)的類器官。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(ii)中所述的細(xì)菌感染液是將細(xì)菌用類器官培養(yǎng)基稀釋后所獲得的溶液，所述的細(xì)菌選自下組：金黃色葡萄球菌，大腸桿菌，綠膿桿菌；所述的細(xì)菌可以是抗菌的或非抗菌的。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(i)中所述的將3d類器官從基質(zhì)膠中釋放是指通過酶解破壞基質(zhì)膠成分，但不破壞類器官的3d結(jié)構(gòu)，獲得懸浮在培養(yǎng)基中的類器官混懸液。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(ii)中，混合共孵育還包括陽性對照組；所述的陽性對照組在已知藥物存在下孵育，其余條件與實驗組和陰性對照組相同...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：謝曉瑞，劉莉，程全，申少磊，鄧文昌，
申請(專利權(quán))人：上海醫(yī)藥工業(yè)研究院有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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