【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于高通量檢測，尤其涉及一種呼吸道合胞病毒疫苗血清中和抗體高通量檢測方法。
技術介紹
1、呼吸道合胞病毒（respiratory?syncytical?virus,rsv）屬于副黏病毒科的肺病毒屬的單負鏈rna病毒，只有一個血清型，分為a/b?2個亞型。是引起嬰幼兒，免疫低下人群和老年人的急性下呼吸道感染的最重要的病毒性病原之一，可引起全年齡段人群的呼吸道感染，病毒感染患者和無癥狀感染者是主要的傳播源，直接接觸是主要的傳播途徑，飛沫和特定條件下也可通過氣溶膠傳播。
2、目前全球已上市3款疫苗，分別是葛蘭素史克（gsk）的arexvy、輝瑞（pfizer）的abrysvo、以及莫德納（moderna）的mrna疫苗用于預防60歲及以上人群因感染rsv引發的下呼吸道疾病。在抗rsv單抗方面，美國食品藥品監督管理局（food?and?drugadministration,fda）宣布適用于所有嬰兒人群預防rsv相關下呼吸道疾病的單克隆抗體尼塞韋單抗獲批，在此之前僅有帕利珠單抗獲批用于患有嚴重疾病的高風險兒童的嚴重下呼吸道感染的預防。
3、目前全球rsv疫苗研發類型主要分為重組蛋白疫苗、病毒樣顆粒疫苗、核酸疫苗、重組載體疫苗、病毒嵌合疫苗和減毒活疫苗等。在呼吸道合胞病毒疫苗產品中，攻毒保護試驗是評判疫苗效力的主要方法之一，但其實驗成本高，需要在特定動物實驗室操作，且耗時較長，且需要的動物模型嚴格，因此不適用于前期大規模疫苗的篩選。使用elisa方法檢測結合抗體無法反應出疫苗對動物的保護作用。因此檢測疫苗
4、因此，開發一種快速的，標準化的測定呼吸道合胞病毒疫苗產生的中和抗體的方法，來提高檢測通量，可以大大縮短疫苗開發過程中非臨床和臨床樣本的檢測周期，同時提供更有效的證明數據。
技術實現思路
1、為解決現有技術中呼吸道合胞病毒疫苗中和抗體結果判斷人工主觀性強、檢測時間過長、計算、通量較低等問題，本專利技術提供了一種呼吸道合胞病毒疫苗血清中和抗體高通量檢測方法，實驗結果全程由儀器讀數，人為的主觀判斷少，結果計算更加科學可靠，與金標準方法具有良好的相關性。
2、具體地，本專利技術的呼吸道合胞病毒疫苗血清中和抗體高通量檢測方法包括：
3、步驟1：在96孔細胞培養板中培養細胞、梯度稀釋單克隆d25抗體、稀釋呼吸道合胞病毒a亞型毒株、將稀釋好的抗體與病毒液混合進行中和反應；
4、步驟2：將步驟1中中和好的樣品加入培養細胞的96孔細胞培養板中進行吸附反應，之后棄去吸附液，洗滌，加入病毒培養液培養；
5、步驟3：免疫熒光實驗，將步驟2中的細胞培養板中的培養液棄去，加入固定液固定，再棄去固定液，洗滌3次，加入稀釋后的單克隆101抗體反應后，再加入稀釋后的fitc熒光二抗，拍照并分析計數；
6、步驟4：使用軟件進行數據處理和結果判定。
7、在一些實施方式中，所述步驟1中的培養細胞具體包括將長成單層的hep-2細胞消化吹勻后，調整細胞濃度為：2×105個/ml，每孔100μl加入96孔細胞培養板，37℃、5%co2培養箱中培養24-48h。
8、在一些實施方式中，所述步驟1中的中和反應具體包括將稀釋好的抗體與稀釋好的病毒等體積混合，37℃、5%co2培養箱中和1小時；病毒對照組為稀釋的病毒與病毒稀釋液等體積混合，細胞對照直接使用病毒稀釋液。
9、在一些實施方式中，所述步驟2中的吸附反應具體包括中和后的樣品100μl加入96孔細胞培養板中，37℃、5%co2培養箱吸附1小時；同時設置細胞對照組，細胞對照組每孔加入100μl病毒稀釋液。
10、在一些實施方式中，所述步驟3中的固定液是-20℃預冷的80%丙酮，加入量為50μl/孔，4℃固定30min。
11、在一些實施方式中，所述步驟3中拍照、分析計數采用elispot分析儀進行。
12、在一些實施方式中，所述步驟4中數據處理包括：①將熒光灶數據使用excel進行處理，同組復孔進行均值計算；②計算檢測值與陰性值的差值，即為真實值；③使用elisacalc軟件處理原始數據，以樣品稀釋倍數的對數值為橫坐標，相應熒光灶點數為縱坐標繪制四參數擬合曲線。
13、在一些實施方式中，所述步驟4中的結果判定包括：使用elisa?calc軟件，進行中和抗體滴度計算，以病毒對照組1/2（即50%熒光灶）的熒光灶數為參照，將其帶入計算公式中，使用軟件計算待檢樣本抑制50%病毒的稀釋倍數即為該樣本的中和抗體滴度；
14、計算公式：
15、；
16、其中，y：檢測樣本的中和抗體滴度
17、x：熒光斑點數
18、a：曲線上漸近線估值
19、d：曲線下漸近線估值
20、b：曲線的斜率
21、c：最大結合一半時對應的劑量。
22、在一些實施方式中，樣品稀釋倍數的對數值與熒光灶點數成良好線性關系，r2大于0.950。
23、在一些實施方式中，所述步驟2中棄去吸附液后用rpmi-1640洗滌，加入病毒培養液100μl/孔，37℃、5%co2培養箱中培養24至48小時。
24、與現有技術相比，本專利技術的優點和積極效果是：
25、本專利技術的間接免疫熒光法檢測呼吸道合胞病毒疫苗免疫后的血清，成功檢測出血清中和抗體滴度，并與金標準的細胞病變法進行相關性分析發現，本專利技術的間接免疫熒光法具有較高的靈敏度和特異性，檢測用時短，實驗結果全程由儀器讀數，人為的主觀判斷少，結果計算更加科學可靠，與金標準方法具有良好的相關性。
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1.一種呼吸道合胞病毒疫苗血清中和抗體高通量檢測方法，其特征在于，所述方法包括：
2.根據權利要求1所述的呼吸道合胞病毒疫苗血清中和抗體高通量檢測方法，其特征在于，所述步驟1中的培養細胞具體包括將長成單層的Hep-2細胞消化吹勻后，調整細胞濃度為：2×105個/mL，每孔100μL加入96孔細胞培養板，37℃、5%CO2培養箱中培養24-48h。
3.根據權利要求1所述的呼吸道合胞病毒疫苗血清中和抗體高通量檢測方法，其特征在于，所述步驟1中的中和反應具體包括將稀釋好的抗體與稀釋好的病毒等體積混合，37℃、5%CO2培養箱中和1小時；病毒對照組為稀釋的病毒與病毒稀釋液等體積混合，細胞對照直接使用病毒稀釋液。
4.根據權利要求1所述的呼吸道合胞病毒疫苗血清中和抗體高通量檢測方法，其特征在于，所述步驟2中的吸附反應具體包括中和后的樣品100μL加入96孔細胞培養板中，37℃、5%CO2培養箱吸附1小時；同時設置細胞對照組，細胞對照組每孔加入100μL病毒稀釋液。
5.根據權利要求1所述的呼吸道合胞病毒疫苗血清中和抗體高通量檢測方法，其特征
6.根據權利要求1所述的呼吸道合胞病毒疫苗血清中和抗體高通量檢測方法，其特征在于，所述步驟3中拍照、分析計數采用ELISPOT分析儀進行。
7.根據權利要求1所述的呼吸道合胞病毒疫苗血清中和抗體高通量檢測方法，其特征在于，所述步驟4中數據處理包括：①將熒光灶數據使用Excel進行處理，同組復孔進行均值計算；②計算檢測值與陰性值的差值，即為真實值；③使用ELISA?Calc軟件處理原始數據，以樣品稀釋倍數的對數值為橫坐標，相應熒光灶點數為縱坐標繪制四參數擬合曲線。
8.根據權利要求1所述的呼吸道合胞病毒疫苗血清中和抗體高通量檢測方法，其特征在于，所述步驟4中的結果判定包括：使用ELISA?Calc軟件，進行中和抗體滴度計算，以病毒對照組1/2的熒光灶數為參照，將其帶入計算公式中，使用軟件計算待檢樣本抑制50%病毒的稀釋倍數即為該樣本的中和抗體滴度；
9.根據權利要求8所述的呼吸道合胞病毒疫苗血清中和抗體高通量檢測方法，其特征在于，樣品稀釋倍數的對數值與熒光灶點數成良好線性關系，R2大于0.950。
10.根據權利要求1所述的呼吸道合胞病毒疫苗血清中和抗體高通量檢測方法，其特征在于，所述步驟2中棄去吸附液后用RPMI-1640洗滌，加入病毒培養液100μL/孔，37℃、5%CO2培養箱中培養24至48小時。
...【技術特征摘要】
1.一種呼吸道合胞病毒疫苗血清中和抗體高通量檢測方法，其特征在于，所述方法包括：
2.根據權利要求1所述的呼吸道合胞病毒疫苗血清中和抗體高通量檢測方法，其特征在于，所述步驟1中的培養細胞具體包括將長成單層的hep-2細胞消化吹勻后，調整細胞濃度為：2×105個/ml，每孔100μl加入96孔細胞培養板，37℃、5%co2培養箱中培養24-48h。
3.根據權利要求1所述的呼吸道合胞病毒疫苗血清中和抗體高通量檢測方法，其特征在于，所述步驟1中的中和反應具體包括將稀釋好的抗體與稀釋好的病毒等體積混合，37℃、5%co2培養箱中和1小時；病毒對照組為稀釋的病毒與病毒稀釋液等體積混合，細胞對照直接使用病毒稀釋液。
4.根據權利要求1所述的呼吸道合胞病毒疫苗血清中和抗體高通量檢測方法，其特征在于，所述步驟2中的吸附反應具體包括中和后的樣品100μl加入96孔細胞培養板中，37℃、5%co2培養箱吸附1小時；同時設置細胞對照組，細胞對照組每孔加入100μl病毒稀釋液。
5.根據權利要求1所述的呼吸道合胞病毒疫苗血清中和抗體高通量檢測方法，其特征在于，所述步驟3中的固定液是-20℃預冷的80%丙酮，加入量為50μl/孔，4℃固定30min。
6.根據權利要求1所述的呼吸道合...
【專利技術屬性】
技術研發人員：陳驍，王海龍，付麗麗，劉曉滿，宋力強，張帥斌，
申請(專利權)人：北京華諾泰生物醫藥科技有限公司，
類型：發明
國別省市：
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