【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及基礎醫學研究，提供一種基于rna-seq快速篩選人源細胞外泌體關鍵標記的方法。
技術介紹
1、液體活檢三大標志物之一的外泌體，近幾年研究熱度持續攀升。不論在腫瘤領域、神經科學領域還是代謝領域，都有大量的外泌體相關文章發表，以探究外泌體的功能和機制。
2、外泌體是一類大小為30-150nm、呈茶托狀的由脂質雙層膜包裹的細胞外囊泡，廣泛存在于細胞培養上清及各種體液中，包括血液、淋巴液、唾液、尿液、卵泡液、精液、心包液、乳汁等。外泌體內含有多種蛋白質(如tsg101、hsp70等)、核酸(dna、rna)和脂質(膽固醇、鞘磷脂等)，這些內容物因釋放外泌體的細胞不同而有比較大的差異。由此可以看出，外泌體是所有細胞產生的胞外小泡，攜帶核酸、蛋白質、脂類和代謝物。它們是健康和疾病細胞間近距離通訊的介質，影響細胞生物學的各個方面，極具研究價值。
3、而為了對外泌體的機制和功能展開研究，首先需要將外泌體從樣本中分離出來，目前比較公認的分離方法是超速離心法，再通過透射電鏡(tem)、納米粒徑跟蹤分析(nta)、westernblot等進行鑒定。獲得外泌體后，對外泌體進行標記，觀察外泌體被攝取情況，再進一步探索外泌體的功能，如組織修復、腫瘤轉移、代謝重建等。以目前的主流觀點來看，外泌體標記對探究外泌體的功能是必不可少的一個步驟，首先需要觀察到外泌體被受體細胞吸收或到達目的組織、器官，再檢測受體細胞、組織或器官中相應指標的變化，看外泌體是否具有一定的功能。確定外泌體具有功能后，再通過高通量測序或基因芯片進行差異表
4、當前外泌體標記的方法主要有：一、親脂性染料標記：目前已發表的外泌體文章中，外泌體大多使用親脂性染料進行標記，體內和體外都有較多應用。親脂性染料主要分為兩大類，第一類是pkh67(綠色熒光)/pkh26(紅色熒光)，由于它們可以與外泌體的脂質雙層膜穩定結合，所以染色效果較好，應用較廣泛。第二類是di系列的親脂性染料，包括dii(橙色熒光)、dio(綠色熒光)、did(紅色熒光)、dir(深紅色熒光)。其中dir的紅外熒光可穿透細胞和組織，在活體成像中用來示蹤。二、慢病毒介導cd63-gfp表達：將外泌體的特定蛋白cd63和綠色熒光蛋白gfp的表達元件構建成質粒再包裝到慢病毒中，隨后用此慢病毒感染細胞，使細胞分泌的外泌體帶有綠色熒光。三、用金納米顆粒(gold?nanoparticles，gnps)標記：將金納米顆粒標記的外泌體通過鼻內給藥不僅能進行無創跟蹤，而且能促進外泌體在腦部的積累和延長在病變區域的存在時間，增強體內神經成像的效果。因此，這種外泌體標記技術可以作為多種腦疾病的強大診斷工具，并可能增強基于外泌體的神經恢復治療。四、用近紅外(nir)熒光探針進行標記：這是一種使用兩親性探針對nir熒光標記的外泌體進行內源性檢測的方法，無需對外泌體進行免疫標記或合成或色譜處理。由于nir波長的熒光探針能穿透體內組織，從而提供了從細胞直接轉換到體內使用的好處。五、用gaussialuciferase(gluc)和截斷的lactadherin標記：將gluc-lactadherin構成融合表達的質粒，再將此質粒轉染細胞，使細胞分泌的外泌體帶有強的螢光素酶活性。將標記的外泌體進行靜脈注射入小鼠體內，看外泌體在組織的分布情況。
5、rna-seq測序(轉錄組測序)是基于二代測序技術的轉錄組學研究方法：首先提取生物樣品的全部轉錄的rna并進行mrna富集，然后反轉錄為cdna后進行的高通量測序，在此基礎上進行片段的拼接組裝，從而可得到一個個的轉錄本，進而可以形成對該生物樣品當前發育狀態的基因表達狀況的全局了解。
技術實現思路
1、專利技術目的：本專利技術目的在于，提供一種不同于現有技術研究路線的基于rna-seq的外泌體研究方法，快速篩選人源細胞外泌體關鍵標記。
2、技術方案：本專利技術所述基于rna-seq快速篩選人源細胞外泌體關鍵標記的方法，包括如下步驟：
3、s1、分別對正常細胞系和該正常細胞系變異的腫瘤細胞系，以及兩者各自的細胞外泌體進行rna-seq測序，并對測序結果進行數據化預處理，得到目標表達矩陣；
4、s2、利用計算機腳本分別篩選正常細胞系和正常細胞系的細胞外泌體的共有基因，腫瘤細胞系和腫瘤細胞系的細胞外泌體的共有基因，獲得兩組細胞外泌體的表達譜數據，將兩組數據合并，得到新的表達譜矩陣；
5、s3、構建wgcna網絡，讀取步驟s2獲得的新的表達譜矩陣進行加權基因共表達網絡分析，識別關鍵基因；
6、s4、從識別出的關鍵基因中提取已有實驗驗證的膜蛋白；
7、s5、使用deseq2進行顯著差異表達分析，提取顯著差異表達基因，繪制出正常細胞系的細胞外泌體和腫瘤細胞系的細胞外泌體顯著差異表達基因的火山圖。
8、本專利技術進一步優選地技術方案為，步驟s1中與同一腫瘤疾病相關的細胞為多種時，將不同細胞分為多組細胞系，對應腫瘤細胞系，以及各自的細胞外泌體也分為多組，并分別進行rna-seq測序。
9、進一步優選地，步驟s2中利用r腳本調用函數進行篩選共有基因。
10、進一步優選地，步驟s4中，首先下載外泌體相關標志物數據庫，然后對照該數據庫與步驟s3識別的關鍵基因，提取已有實驗驗證的膜蛋白。
11、優選地，在獲得顯著差異表達基因后，通過富集進行基因功能富集分析。
12、有益效果：本專利技術提供一種基于rna-seq快速篩選人源細胞外泌體關鍵標記的方法，能夠快速的對某一類病變細胞進行外泌體分析，不需要進行生物標記，直接獲得腫瘤細胞的細胞外泌體顯著差異表達基因，完成細胞外泌體關鍵標記；在此基礎上可以通過富集的方式，對顯著差異表達基因進行富集從而進行功能分析。
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1.一種基于RNA-seq快速篩選人源細胞外泌體關鍵標記的方法，其特征在于，包括如下步驟：
2.根據權利要求1所述的基于RNA-seq快速篩選人源細胞外泌體關鍵標記的方法，其特征在于，步驟S1中與同一腫瘤疾病相關的細胞為多種時，將不同細胞分為多組細胞系，對應腫瘤細胞系，以及各自的細胞外泌體也分為多組，并分別進行RNA-seq測序。
3.根據權利要求1所述的基于RNA-seq快速篩選人源細胞外泌體關鍵標記的方法，其特征在于，步驟S2中利用R腳本調用函數進行篩選共有基因。
4.根據權利要求1所述的基于RNA-seq快速篩選人源細胞外泌體關鍵標記的方法，其特征在于，步驟S4中，首先下載外泌體相關標志物數據庫，然后對照該數據庫與步驟S3識別的關鍵基因，提取已有實驗驗證的膜蛋白。
5.根據權利要求1所述的基于RNA-seq快速篩選人源細胞外泌體關鍵標記的方法，其特征在于，在獲得顯著差異表達基因后，通過富集進行基因功能富集分析。
【技術特征摘要】
1.一種基于rna-seq快速篩選人源細胞外泌體關鍵標記的方法，其特征在于，包括如下步驟：
2.根據權利要求1所述的基于rna-seq快速篩選人源細胞外泌體關鍵標記的方法，其特征在于，步驟s1中與同一腫瘤疾病相關的細胞為多種時，將不同細胞分為多組細胞系，對應腫瘤細胞系，以及各自的細胞外泌體也分為多組，并分別進行rna-seq測序。
3.根據權利要求1所述的基于rna-seq快速篩選人源細胞外泌體關鍵標記的方法，...
【專利技術屬性】
技術研發人員：蔣瀾，呂坤，鐘民，楊建課，張夢瑩，馬迪迪，溫宇晶，趙珍珍，羅天樂，汪樂瑤，
申請(專利權)人：皖南醫學院第一附屬醫院皖南醫學院弋磯山醫院，
類型：發明
國別省市：
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