【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及精原干細胞分離，尤其涉及一種藏綿羊原代精原干細胞分離、純化及培養方法及其應用。
技術介紹
1、精原干細胞(spermatogonia?stem?cells，sscs)是指位于曲精細管基膜上既能自我更新維持自身適量恒定，又能定向分化產生精母細胞的一類原始精原細胞。隨著雄性動物的出生，原始生殖細胞轉化為生殖母細胞，遷移到生精小管基膜部，并分化為精原干細胞。一個精原干細胞最終能產生4096個精子。實際上，盡管有75％～90％的細胞在分化過程中死于凋亡，一個精原干細胞仍然能夠產生400～1000個精子，可見精原干細胞分化產生精子的效率很高。從動物個體的青春期直到年老，精原干細胞既能自我復制，又能進入精子發生過程，經過一系列分化，最終產生精子，經過與卵子結合將基因組傳給下一代。它們憑借既能在成體中自我復制又能代代相傳而被視為永生細胞。
2、綿羊精原干細胞的分離純化和長期培養是困擾學者的重要難題。雖然鼠類的精原干細胞長期培養方法已經建立，由于種族差別、基因庫差別、市售抗體不能通用等多種因素的存在，綿羊精原干細胞的長期培養方法不能照搬鼠類的方法。綿羊精原干細胞分離純化、傳代長期培養技術操作體系還沒有成功的報道。
3、目前的精原干細胞分離純化方法主要有：隱睪手術富集法、酶解法、percoll密度梯度離心法、流式細胞術分選法、免疫磁珠分選法、差異貼壁法等方法等。流式細胞術分選法和免疫磁珠分選法在鼠類精原干細胞中應用效果較好，但是兩種方法都需要有與所研究物種的精原干細胞表面抗原特異性很好結合的抗體，而目前適用于
4、目前已有學者使用酶解法+差異貼壁法成功分離精原干細胞的報道，但是使用酶解法+差異貼壁法的關鍵在于制備的單細胞懸浮液中含有的精原干細胞要純度高、數量多、活性好，而不同動物睪丸生精上皮細胞的組織結構各有差異，使用酶解法消化周邊組織、釋放支持細胞和精原干細胞時，消化酶的種類和濃度、作用強度(轉速)、消化時間、緩沖液成分等都是影響消化程度的因素，任何一個因素不合適，都影響生精上皮的消化和釋放精原干細胞，導致單細胞懸浮液中的精原干細胞數量少質量差，最后通過差異貼壁法純化也不能獲得足夠數量的活力好的精原干細胞；就算制備了高質量的單細胞懸浮液，在純化精原干細胞的操作過程中，分離順序、分離時間、沖洗次數、沖洗力度等具體操作方法又都是影響最后收集的精原干細胞數量和質量的因素，掌握不好時照樣不能獲得高活力的精原干細胞。因此，雖然酶解法+差異貼壁法從原理上看比較簡單，使用的器械和試劑也都比較常用，但是由于物種不同、各個操作環節的要求不同、會直接影響精原干細胞的分離純化效果。致使用酶解法+差異貼壁法成功分離純化綿羊精原干細胞的方法還沒有成功的報道。
5、因此，如何提供一種藏綿羊原代精原干細胞分離、純化及培養方法，以解決現有技術中綿陽原代精原干細胞分離難，純化及培養方法復雜，效果差的技術問題，是本領域技術人員亟需解決的問題。
技術實現思路
1、本專利技術的目的在于提供一種藏綿羊原代精原干細胞分離、純化及培養方法及其應用。本專利技術方法簡單易行，能有效分離、純化得到藏綿羊原代精原干細胞，精原干細胞純度高。
2、為了實現上述專利技術目的，本專利技術提供以下技術方案：
3、本專利技術提供了一種藏綿羊原代精原干細胞分離、純化及培養方法，包括如下步驟：
4、(1)依次使用混合酶液和酶解液處理藏綿羊睪丸組織，得到曲細精管的單細胞懸液；所述混合酶液為膠原酶、dnaseⅰ酶、透明質酸酶和dispase分解酶中的一種、兩種或多種；所述酶解液為胰酶和/或dnaseⅰ酶；
5、(2)使用差速貼壁法純化步驟(1)得到的曲細精管的單細胞懸液，得到精原干細胞；
6、(3)將步驟(2)得到的精原干細胞接種于飼養層中培養。
7、優選的，步驟(2)所述差速貼壁法使用的介質為濃度為0.08～0.12％明膠、濃度為0.18～0.22％明膠或多聚賴氨酸。
8、優選的，步驟(1)當混合酶液為膠原酶和dnaseⅰ酶時，酶解液的選擇為胰酶和dnaseⅰ酶；
9、當混合酶液為膠原酶、透明質酸酶、dnaseⅰ酶時，酶解液的選擇為胰酶；
10、當混合酶液為膠原酶、dispase分解酶、dnaseⅰ酶時，酶解液的選擇為胰酶。
11、優選的，步驟(1)所述混合酶液中，膠原酶的使用濃度為0.25～2.00mg/ml；dnaseⅰ酶的使用濃度為20μg/ml～7mg/ml；透明質酸酶的使用濃度為1～3mg/ml；dispase分解酶的使用濃度為1～3mg/ml。
12、優選的，步驟(1)所述酶解液中，胰酶的使用濃度為0.15～0.35％(v/v)；dnaseⅰ酶的使用濃度為5～9mg/ml。
13、優選的，步驟(2)所述多聚賴氨酸的使用濃度為0.5～1.5mg/ml；所述差速貼壁法差速貼壁的次數為1～3次。
14、優選的，步驟(2)所述差速貼壁法為：以濃度為0.5～1.5mg/ml多聚賴氨酸為介質，將培養瓶底部包裹、培育后棄液、沖洗，然后加入培養基并接種曲細精管的單細胞懸液，培養后收集細胞懸液，離心。
15、優選的，步驟(2)所述差速貼壁法為：1)以濃度為0.08～0.12％明膠、濃度為0.18～0.22％明膠或多聚賴氨酸為介質，將培養瓶底部包裹、培育后棄液、沖洗，然后加入培養基并接種曲細精管的單細胞懸液，培養后收集細胞懸液，離心，得到純化后的曲細精管的單細胞懸液；2)將所述純化后的曲細精管的單細胞懸液并重復步驟1)的方法兩次。
16、優選的，步驟(2)所述差速貼壁法為：將percoll工作液與曲細精管的單細胞懸液混合離心棄上清，清洗后離心再棄上清，得到細胞懸液；以濃度為0.08～0.12％明膠為介質將培養瓶底部包裹、培育后棄液、沖洗，然后加入培養基并接種曲細精管的單細胞懸液，培養后收集細胞懸液，離心。
17、本專利技術還提供了所述的方法制得的藏綿羊原代精原干細胞在藏綿羊輔助育種中的應用。
18、與現有技術相比，本專利技術具有如下的有益效果：
19、本專利技術在精原干細胞的分離過程中采用兩步酶結合dnaseⅰ酶的消化方法，操作簡單、方便且得到的單細胞懸液中精原干細胞的比例更高；進一步對分離得到的單細胞懸液采用30％percoll離心、0.1％明膠差速貼壁24h得到的精原干細胞純度達到80％以上，與其他方法相比，該方法操作簡單，所需成本低、且純化出的精原干細胞純度更高，滿足細胞轉染、遺傳修飾等細胞操作。
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1.一種藏綿羊原代精原干細胞分離、純化及培養方法，其特征在于，包括如下步驟：
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)所述差速貼壁法使用的介質為濃度為0.08～0.12％明膠、濃度為0.18～0.22％明膠或多聚賴氨酸。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)當混合酶液為膠原酶和DnaseⅠ酶時，酶解液的選擇為胰酶和DnaseⅠ酶；
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)所述混合酶液中，膠原酶的使用濃度為0.25～2.00mg/mL；DnaseⅠ酶的使用濃度為20μg/mL～7mg/mL；透明質酸酶的使用濃度為1～3mg/mL；Dispase分解酶的使用濃度為1～3mg/mL。
5.根據權利要求1或3所述的方法，其特征在于，步驟(1)所述酶解液中，胰酶的使用濃度為0.15～0.35％(V/V)；DnaseⅠ酶的使用濃度為5～9mg/mL。
6.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(2)所述多聚賴氨酸的使用濃度為0.5～1.5mg/mL；所述差速貼壁法差速貼壁的次數為1～3次。
7.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(2)所述差速貼壁法為：以濃度為0.08～0.12％明膠、濃度為0.18～0.22％明膠或多聚賴氨酸為介質，將培養瓶底部包裹、培育后棄液、沖洗，然后加入培養基并接種曲細精管的單細胞懸液，培養后收集細胞懸液，離心。
8.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(2)所述差速貼壁法為：1)以濃度為0.08～0.12％明膠為介質，將培養瓶底部包裹、培育后棄液、沖洗，然后加入培養基并接種曲細精管的單細胞懸液，培養后收集細胞懸液，離心，得到純化后的曲細精管的單細胞懸液；2)將所述純化后的曲細精管的單細胞懸液并重復步驟1)的方法兩次。
9.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(2)所述差速貼壁法為：將Percoll工作液與曲細精管的單細胞懸液混合離心棄上清，清洗后離心再棄上清，得到細胞懸液；以濃度為0.08～0.12％明膠為介質將培養瓶底部包裹、培育后棄液、沖洗，然后加入培養基并接種曲細精管的單細胞懸液，培養后收集細胞懸液，離心。
10.權利要求1～9任一項所述的方法制得的藏綿羊原代精原干細胞在藏綿羊輔助育種中的應用。
...【技術特征摘要】
1.一種藏綿羊原代精原干細胞分離、純化及培養方法，其特征在于，包括如下步驟：
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)所述差速貼壁法使用的介質為濃度為0.08～0.12％明膠、濃度為0.18～0.22％明膠或多聚賴氨酸。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)當混合酶液為膠原酶和dnaseⅰ酶時，酶解液的選擇為胰酶和dnaseⅰ酶；
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)所述混合酶液中，膠原酶的使用濃度為0.25～2.00mg/ml；dnaseⅰ酶的使用濃度為20μg/ml～7mg/ml；透明質酸酶的使用濃度為1～3mg/ml；dispase分解酶的使用濃度為1～3mg/ml。
5.根據權利要求1或3所述的方法，其特征在于，步驟(1)所述酶解液中，胰酶的使用濃度為0.15～0.35％(v/v)；dnaseⅰ酶的使用濃度為5～9mg/ml。
6.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(2)所述多聚賴氨酸的使用濃度為0.5～1.5mg/ml；所述差速貼壁法差速貼壁的次數為1～3次。
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【專利技術屬性】
技術研發人員：安雪姣，盧曾奎，張淼荗，袁超，劉建斌，
申請(專利權)人：中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所，
類型：發明
國別省市：
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