【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及工程菌株改造領域，具體涉及一種構建5-ala高產工程菌株的方法、工程菌株以及發酵生產5-ala的方法。
技術介紹
1、5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic?acid)，又稱5-氨基-4-酮戊酸，簡稱5-ala，是生物體內天然存在的一種功能性非蛋白質氨基酸，它是所有卟啉化合物(血紅素、葉綠素、維生素b12以及細胞色素)生物合成的共同前體，廣泛存在于細菌、真菌、動物及植物等生命體內，對細胞能量代謝有重要影響。ala具有生物可降解和無毒無殘留的優點，在醫藥、農藥、化工等領域應用廣泛。
2、在農業領域，5-ala具有促進植物生長作用，能提高農作物產量及品質；在醫藥領域，5-ala適用于糖尿病、癌癥的預防、診斷和治療；在化妝品領域，5-ala具有保濕功能，有助于提高皮膚水分量和彈性；在飼料領域，5-ala可使肌蛋白合成速度加快，改善貧血，進而提升禽畜免疫力。受生產技術、成本等因素限制，目前醫藥、農業是5-ala主要應用場景，其他領域尚未得到有效開發。
3、微生物發酵法合成5-ala的生產成本高，仍不能滿足應用市場需求。5-ala的生物合成有c4和c5兩條途徑，c4途徑：由琥珀酰coa和甘氨酸經5-氨基乙酰丙酸合酶(alas)催化縮合生成5-ala。c5途徑：以谷氨酸為底物，經過谷氨酰trna合成酶glurs，nadph依賴的谷氨酰-trna-還原酶hema和谷氨酸-1-半醛氨基轉移酶heml，三步催化生成5-ala。其中c5途徑以trna-glu作為合成中間體，需atp和nadph作為輔
4、中國專利申請cn112980758a公開了一種提高谷氨酸棒桿菌合成5-氨基乙酰丙酸產量的方法，通過敲除α-酮戊二酸抑制蛋白和琥珀酸脫氫酶以及過表達5-氨基乙酰丙酸合成酶，重組谷氨酸棒桿菌的構建，48h合成了25.05g/l的5-ala。中國專利cn114369562b公開了一種提高5-氨基乙酰丙酸表達量的方法，其在谷氨酸棒狀桿菌刪除谷氨酸脫氫酶基因gdha，過表達ala合成酶基因hema和吡哆醛激酶的編碼基因pyka，5-ala產量提高了39.5％。
5、雖然現有技術已公開通過生物合成提高5-氨基乙酰丙酸表達量的方法，但仍然需要進一步提高5-氨基乙酰丙酸的生產效率，進一步降低生產成本。
技術實現思路
1、為解決以上技術問題，本專利技術旨在提供一種構建5-ala高產工程菌株的方法。
2、本專利技術的另一目的是提供一種高產5-ala的工程菌株。
3、本專利技術的再一目的是提供一種發酵生產5-ala的方法。
4、根據本專利技術的構建5-ala高產工程菌株的方法，包括以下步驟：
5、以谷氨酸棒狀桿菌為出發菌株，敲除dna限制修飾基因mrr；
6、敲除琥珀酰輔酶a合成酶基因succ、谷氨酸脫氫酶基因gdha、α-酮戊二酸抑制蛋白基因odhi、異檸檬酸裂解酶基因acea和丙氨酸合成酶基因alat；
7、在基因組上整合吡哆醛激酶編碼基因pdk；
8、弱化5-氨基乙酰丙酸脫水酶基因hemb表達；
9、導入5-氨基乙酰丙酸合成酶基因。
10、根據本專利技術的構建5-ala高產工程菌株的方法，所述方法進一步包括以下步驟：
11、敲除nadph依賴的fmn還原酶基因frd,導入甘氨酸轉運蛋白編碼基因cyca。
12、根據本專利技術的構建5-ala高產工程菌株的方法，所述方法進一步包括以下步驟：
13、導入攜帶5-氨基乙酰丙酸合成酶基因、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc基因和泛酸激酶ptk基因。
14、根據本專利技術的構建5-ala高產工程菌株的方法，所述方法進一步包括以下步驟：
15、導入5-ala外排蛋白編碼基因eama和dna氧化損傷修復蛋白編碼基因。
16、根據本專利技術的構建5-ala高產工程菌株的方法，通過導入hemb基因的sirna干擾基因、導入rna干擾輔助蛋白編碼基因hfq弱化所述5-氨基乙酰丙酸脫水酶基因hemb表達。
17、根據本專利技術的構建5-ala高產工程菌株的方法，包括以下步驟：
18、以谷氨酸棒狀桿菌為出發菌株，敲除dna限制修飾基因mrr、琥珀酰輔酶a合成酶基因succ(seq?id?no：12)、谷氨酸脫氫酶基因gdha(seq?id?no：13)、α-酮戊二酸抑制蛋白基因odhi(seq?id?no：14)、異檸檬酸裂解酶基因acea(seq?id?no：15)和丙氨酸合成酶基因alat(seq?id?no：16)，在基因組上整合吡哆醛激酶編碼基因pdk(seq?id?no：8)，構建得到底盤菌株d2；
19、在底盤菌株d2的基礎上，弱化5-氨基乙酰丙酸脫水酶基因(hemb)表達，構建得到底盤菌株d3；
20、在所述底盤菌株d3的基礎上，導入5-氨基乙酰丙酸合成酶基因(seq?id?no：2)，構建得到表達菌株v3。
21、根據本專利技術的構建5-ala高產工程菌株的方法，進一步包括以下步驟：
22、在底盤菌株d3的基礎上，敲除nadph依賴的fmn還原酶基因frd(seq?id?no：11),導入甘氨酸轉運蛋白編碼基因cyca(seq?id?no：7)，構建得到底盤菌株d4。
23、根據本專利技術的構建5-ala高產工程菌株的方法，進一步包括以下步驟：在底盤菌株d4的基礎上，導入攜帶5-氨基乙酰丙酸合成酶基因(seq?id?no：2)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(seq?id?no：3)和泛酸激酶基因(seq?id?no：5)的質粒后，構建表達菌株v5。
24、根據本專利技術的構建5-ala高產工程菌株的方法，進一步包括以下步驟：
25、在表達菌株v5的基礎上上，導入攜帶5-ala外排蛋白編碼基因(seq?id?no：4)和dna氧化損傷修復蛋白編碼基因(seq?id?no：6)的質粒，構建表達菌株v6。
26、根據本專利技術的構建5-ala高產工程菌株的方法，其中，通過導入hemb基因的sirna干擾基因(seq?id?no：10)、導入rna干擾輔助蛋白編碼基因hfq(seq?idno：9)弱化5-氨基乙酰丙酸脫水酶基因(hemb)表達。
27、本專利技術提供了通過上述方法構建的工程菌株。
28、本專利技術的有益效果：
29、1.通過本專利技術方法獲得的工程菌株，在5l發酵罐中，經過補料發酵，5-氨基乙酰丙酸的效價可達28g/l。
30、2.本專利技術方法改變宿主細胞的代謝途徑，使得5-ala得以積累，并通過增強5-ala本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種構建5-ALA高產工程菌株的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的構建5-ALA高產工程菌株的方法，其特征在于，所述方法進一步包括以下步驟：
3.根據權利要求2所述的構建5-ALA高產工程菌株的方法，其特征在于，所述方法進一步包括以下步驟：
4.根據權利要求3所述的構建5-ALA高產工程菌株的方法，其特征在于，所述方法進一步包括以下步驟：
5.根據權利要求1所述的構建5-ALA高產工程菌株的方法，其特征在于，通過導入HemB基因的siRNA干擾基因、導入RNA干擾輔助蛋白編碼基因Hfq弱化所述5-氨基乙酰丙酸脫水酶基因hemB表達。
6.通過權利要求1～5任意一項所述的構建5-ALA高產工程菌株的方法構建的工程菌株。
7.一種發酵生產5-ALA的方法，其特征在于，所述方法包括利用權利要求6所述的工程菌株進行發酵的步驟。
8.根據權利要求7所述的發酵生產5-ALA的方法，其特征在于，發酵過程中使用的發酵液配方為：蛋白胨10g/L，酵母提取物15g/L，氯化鈉2.5
9.根據權利要求7所述的發酵生產5-ALA的方法，其特征在于，發酵初期溫度30℃，通氣量30L/min，初始轉速400rpm，pH?7.0，菌體生長時轉速聯動的溶氧值不低于30％，當菌體濕重達到100g/L，添加IPTG誘導，pH?6.5，流加100g/L的甘氨酸和100g/L的琥珀酸，周期為600s，開度為1s，誘導2h后，補加泛酸鈣0.2g/L，
...【技術特征摘要】
1.一種構建5-ala高產工程菌株的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的構建5-ala高產工程菌株的方法，其特征在于，所述方法進一步包括以下步驟：
3.根據權利要求2所述的構建5-ala高產工程菌株的方法，其特征在于，所述方法進一步包括以下步驟：
4.根據權利要求3所述的構建5-ala高產工程菌株的方法，其特征在于，所述方法進一步包括以下步驟：
5.根據權利要求1所述的構建5-ala高產工程菌株的方法，其特征在于，通過導入hemb基因的sirna干擾基因、導入rna干擾輔助蛋白編碼基因hfq弱化所述5-氨基乙酰丙酸脫水酶基因hemb表達。
6.通過權利要求1～5任意一項所述的構建5-ala高產工程菌株的方法...
【專利技術屬性】
技術研發人員：徐鐘，韋欣，陶怡，李陽源，林影，
申請(專利權)人：廣東溢多利生物科技股份有限公司，
類型：發明
國別省市：
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