【技術實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術屬于生物，具體涉及isg15-(h4)2-ifn-λ3重組蛋白及應用。
技術介紹
1、ifn是宿主細胞在病毒或其他刺激因子的作用下產(chǎn)生的一種具有抗病毒活性的蛋白質(zhì)，具有廣譜的抗病毒作用和免疫調(diào)節(jié)作用，在天然免疫中發(fā)揮著重要功能。干擾素根據(jù)其編碼基因序列及受體類型不同可分為三大家族：ifn-ⅰ、ifn-ⅱ、ifn-ⅲ。ifn-ⅲ主要由上皮細胞產(chǎn)生，ifn-ⅲ受體由ifn-λ受體1（interferon?lambda?receptor?1，ifnlr1）和白介素10受體2（interleukin?10?receptor?2，il10r2）組成。ifnlr1受體僅在部分細胞中表達，主要位于上皮細胞，特別在是腎臟、肺和胃腸道的上皮細胞中廣泛存在，也存在于一些免疫細胞如中性粒細胞、b淋巴細胞、樹突狀細胞等。ifn-ⅲ被認為是天然免疫反應中的抗病毒細胞因子，其家族成員均表現(xiàn)出對一系列病毒的抗病毒活性，特別是對胃腸道、肺臟等部位的上皮細胞能夠提供有效的抗病毒作用，這主要是由于ifn-ⅲ的ifnlr1受體大部分位于上皮組織。在上皮細胞的病毒感染中，上皮細胞通過表達更多的過氧化酶體和tlr促進ifn-ⅲ的產(chǎn)生并作用于鄰近的上皮細胞從而誘導上皮細胞的抗病毒作用。在黏膜相關的病毒感染中，主要依靠上皮細胞產(chǎn)生ifn-ⅲ并作用于鄰近的上皮細胞從而發(fā)揮抗病毒作用。因此，ifn-ⅲ也被認為是黏膜防御的第一道屏障。
2、ifn-ⅲ也有很強的免疫調(diào)節(jié)功能。免疫細胞如中性粒細胞表面的ifnlr1受體表達水平較高。當中性粒細胞受到ifn-λ刺激
3、干擾素刺激基因15（interferon-stimulated?gene?15，isg15）是一種干擾素誘導的泛素樣蛋白，屬于泛素樣蛋白家族成員，在宿主對病毒感染的反應中發(fā)揮著重要作用。在天然免疫應答初始階段產(chǎn)生的isgs中，isg15是ifn刺激細胞后表達水平最高的isgs之一。isg15通過一個三級酶級聯(lián)反應即isg修飾（isgylation）作用與蛋白底物進行偶聯(lián)來發(fā)揮功能。研究表明，isgylation修飾似乎不直接使靶蛋白降解，而是通過與泛素競爭蛋白上的泛素結合位點來間接調(diào)節(jié)靶蛋白的降解并影響蛋白的功能。isg15所介導的isgylation對牛痘病毒、新城疫病毒、丙型病毒性肝炎、乙型腦炎病毒等多種病毒具有抑制作用。isgylation可以通過靶向病毒感染細胞時的蛋白質(zhì)來抑制病毒基因組的復制，還可以通過靶向病毒出芽和釋放所需的宿主蛋白來抑制病毒的排出。此外，isgylation能夠靶向宿主代謝相關的蛋白質(zhì)從而影響病毒基因組的復制。除介導isgylation修飾外，isg15也能通過非偶聯(lián)的形式分泌到細胞外發(fā)揮類似細胞因子的作用。在受到ifns刺激后或其他致病因子刺激后，isg15可以被成纖維細胞、中性粒細胞、單核細胞和淋巴細胞等多種細胞分泌和釋放。isg15可以發(fā)揮類似細胞因子的功能來參與宿主免疫調(diào)節(jié)功能。
4、目前，ifn的生產(chǎn)除了從豬白細胞中分離外，主要依靠基因工程方法進行表達純化。將ifn的目的基因插入宿主基因，誘導宿主基因表達ifn，并通過一定的方法進行純化，從而獲取ifn。常用的ifn表達系統(tǒng)有大腸桿菌表達系統(tǒng)、酵母表達系統(tǒng)、桿狀病毒表達系統(tǒng)、腺病毒表達系統(tǒng)等，桿狀病毒和酵母表達系統(tǒng)生產(chǎn)出來的蛋白活性優(yōu)于大腸桿菌表達系統(tǒng)，能夠正確折疊并發(fā)揮生物學活性，但是蛋白表達量低、生產(chǎn)周期及生產(chǎn)成本高，難以大規(guī)模生產(chǎn)應用。而大腸桿菌表達系統(tǒng)生產(chǎn)成本低、生產(chǎn)周期短、蛋白表達量高，因此利用大腸桿菌表達系統(tǒng)進行ifn的表達更加適合生產(chǎn)實踐中的應用。但是，大腸桿菌表達系統(tǒng)產(chǎn)生的蛋白多為包涵體表達，難以正確折疊并復性成功，例如連丹花（“ⅲ型干擾素ifn-λ的表達純化及活性鑒定”[d]）構建了bl21/pet26b（+）/?ifn-λ3原核表達菌株，并通過1?μg/ml的iptg誘導劑成功誘導出可溶性ifn-λ3重組蛋白，但是重組蛋白在胞周質(zhì)內(nèi)總體表達量偏低。
5、因而，如何實現(xiàn)ifn-λ3的大規(guī)模生產(chǎn)是ifn-ⅲ制劑開發(fā)中面臨的重大技術問題。
技術實現(xiàn)思路
1、為了解決現(xiàn)有技術中ifn-λ3蛋白表達量低、生產(chǎn)周期及生產(chǎn)成本高，難以大規(guī)模生產(chǎn)應用的技術問題，本專利技術旨在提供一種isg15-(h4)2-ifn-λ3重組蛋白及其應用。
2、為了達到上述目的，本專利技術提供如下技術方案：
3、第一方面，本專利技術提供isg15-(h4)2-ifn-λ3重組蛋白，所述isg15-(h4)2-ifn-λ3重組蛋白通過連接肽(h4)2將isg15與ifn-λ3連接起來，所述isg15-(h4)2-ifn-λ3重組蛋白具有如seq?id?no:1所示的氨基酸序列。
4、第二方面，提供多核苷酸，所述多核苷酸編碼本專利技術所述的isg15-(h4)2-ifn-λ3重組蛋白，所述多核苷酸具有如seq?id?no:2所示的核苷酸序列。
5、第三方面，提供多核苷酸構建體，所述多核苷酸構建體含有如本專利技術所述的多核苷酸。
6、第四方面，提供宿主細胞，所述宿主細胞含有如本專利技術所述的多核苷酸。
7、第五方面，提供重組載體pet-28a-isg15-(h4)2-λ3，所述重組載體pet-28a-isg15-(h4)2-λ3含有如本專利技術所述的多核苷酸。
8、第六方面，提供重組菌株，所述重組菌株含有如本專利技術所述的重組載體pet-28a-isg15-(h4)2-λ3。
9、優(yōu)選的，所述重組菌株為大腸桿菌。
10、更優(yōu)選的，所述重組菌株為大腸桿菌bl21（de3）。
11、第七方面，提供一種大規(guī)模制備ifn-λ3蛋白的方法，所述方法包括：將本專利技術所述的重組載體pet-28a-isg15-(h4)2-λ3轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞后得到重組菌，經(jīng)誘導表達獲得isg15-(h4)2-ifn-λ3重組蛋白。
12、優(yōu)選的，所述感受態(tài)細胞為感受態(tài)細胞bl21（de3）。
13、優(yōu)選的，所述isg15-(h4)2-ifn-λ3重組蛋白用于制備預防和/或治療病毒感染導致的動物疾病的藥物，所述病毒為新城疫病毒ndv或豬繁殖與呼吸綜合征病毒prrsv。
14、優(yōu)選的，所述動物為豬。
15、第八方面，提供本專利技術所述的isg15-(h4)2-ifn-λ3重組蛋白在制備藥物中的應用，所述藥物用于激活細胞的jak/stat信號通路并誘導isgs的產(chǎn)生。本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術保護點】
1.?ISG15-(H4)2-IFN-λ3重組蛋白，其特征在于，所述ISG15-(H4)2-IFN-λ3重組蛋白通過連接肽(H4)2將ISG15與IFN-λ3連接起來，所述ISG15-(H4)2-IFN-λ3重組蛋白具有如SEQID?NO:1所示的氨基酸序列。
2.?多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸編碼權利要求1所述的ISG15-(H4)2-IFN-λ3重組蛋白，所述多核苷酸具有如SEQ?ID?NO:2所示的核苷酸序列。
3.多核苷酸構建體，其特征在于，所述多核苷酸構建體含有如權利要求2所述的多核苷酸。
4.宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞含有如權利要求2所述的多核苷酸。
5.重組載體pET-28a-ISG15-(H4)2-λ3，其特征在于，所述重組載體pET-28a-ISG15-(H4)2-λ3含有如權利要求2所述的多核苷酸。
6.重組菌株，其特征在于，所述重組菌株含有如權利要求5所述的重組載體pET-28a-ISG15-(H4)2-λ3。
7.根據(jù)權利要求6所述的重組菌株，其特征在于，所述重組菌株為大
8.權利要求1所述的ISG15-(H4)2-IFN-λ3重組蛋白在制備藥物中的應用，其特征在于，所述藥物用于激活細胞的JAK/STAT信號通路并誘導ISGs的產(chǎn)生。
...【技術特征摘要】
1.?isg15-(h4)2-ifn-λ3重組蛋白，其特征在于，所述isg15-(h4)2-ifn-λ3重組蛋白通過連接肽(h4)2將isg15與ifn-λ3連接起來，所述isg15-(h4)2-ifn-λ3重組蛋白具有如seqid?no:1所示的氨基酸序列。
2.?多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸編碼權利要求1所述的isg15-(h4)2-ifn-λ3重組蛋白，所述多核苷酸具有如seq?id?no:2所示的核苷酸序列。
3.多核苷酸構建體，其特征在于，所述多核苷酸構建體含有如權利要求2所述的多核苷酸。
4.宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞含有...
【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：鄭旭，張恕存，南雨辰，武春燕，周照斌，
申請(專利權)人：西北農(nóng)林科技大學深圳研究院，
類型：發(fā)明
國別省市：
還沒有人留言評論。發(fā)表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。