【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及微生物基因檢測，具體涉及一種用于病原微生物的單端多重pcr建庫方法。
技術(shù)介紹
1、病原微生物檢測技術(shù)主要分為傳統(tǒng)培養(yǎng)法、免疫學(xué)法和分子生物學(xué)法。傳統(tǒng)檢測主要分為三類：涂片鏡檢、分離培養(yǎng)與生化反應(yīng)、組織細(xì)胞培養(yǎng)；免疫學(xué)法主要包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(elisa)、免疫熒光法等；基因檢測主要以核酸分子雜交技術(shù)、pcr技術(shù)和基因芯片技術(shù)為主。
2、現(xiàn)有的基因檢測法存在一定的缺陷：基于培養(yǎng)的傳統(tǒng)檢測方法主要適用在細(xì)菌和真菌上，菌種培養(yǎng)周期較長，依賴操作人員的培養(yǎng)技術(shù)，且無法檢測生長在培養(yǎng)基上的病原體，培養(yǎng)過程較容受到污染，結(jié)果鑒定精度低，易造成假陽性。免疫學(xué)法檢測病原微生物需要特定的試劑和設(shè)備，且不能檢測所有病原體。基于特異引物/探針/抗體的方法例如抗原抗體反應(yīng)、pcr反應(yīng)檢測以及各種特異性的病原微生物快速檢測方法均需要專業(yè)的微生物領(lǐng)域知識(shí)、無法實(shí)現(xiàn)高通量檢測。mngs技術(shù)對于胞內(nèi)菌、真菌兩類微生物檢測靈敏度較低，一般樣本類型如血液、肺泡灌洗液、痰液、胸腹水等，宿主基因組污染比例一般在80％以上，這就導(dǎo)致測到的微生物序列非常少，很大一部分?jǐn)?shù)據(jù)都無法有效利用，對于rna病毒樣本，由于rna需要經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄過程，且易降解，對rna病毒檢測存在一定的難度。目前mngs單項(xiàng)檢測(dna或rna)，終端收費(fèi)相對較昂貴，如非危難、重癥患者，一般難以接收檢測。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，提供一種用于病原微生物的單端多重pcr建庫方法，它使用單端
2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)采用以下技術(shù)方案是：一種用于病原微生物的單端多重pcr建庫方法，它包括以下步驟：
3、步驟一：引物設(shè)計(jì)，從ncbi下載參考基因組，并滑動(dòng)產(chǎn)生kmer序列，使用blast比對到nt參考庫，過濾非特異kmer，使用mfeprimer篩選合適的引物序列，從每個(gè)物種挑選出一對內(nèi)外側(cè)引物序列；使用內(nèi)側(cè)引物在外側(cè)引物基礎(chǔ)上進(jìn)行pcr擴(kuò)增，增強(qiáng)特異性，再根據(jù)自行設(shè)計(jì)的引物序列，合成引物；
4、步驟二：cdna一鏈合成，將1st?strand?buffer取出，解凍后顛倒混勻，在pcr管中加入6μl混勻后的1st?strand?buffer、17μl的rna、2μl的1st?strand?enzyme?mix2配制成反應(yīng)液，使用移液器吸打混勻，瞬時(shí)離心，再將反應(yīng)液放置于pcr儀上，運(yùn)行程序，得到產(chǎn)物a；
5、步驟三：cdna二鏈合成，將2nd?strand?buffer取出解凍后，顛倒混勻，在pcr管中加入20μl混勻后的2nd?strand?buffer、25μl的產(chǎn)物a、5μl的2nd?strand?enzyme?mix2配制成反應(yīng)液，使用移液器吸打混勻，瞬時(shí)離心，再將反應(yīng)液放置于pcr儀上，運(yùn)行程序，得到產(chǎn)物b；
6、步驟四：逆轉(zhuǎn)錄后純化，取90μl磁珠于管中，加入產(chǎn)物b，混勻后室溫靜置10min，再瞬時(shí)離心，置于磁力架上靜置5min，待液體澄清后棄上清液，再加入180μl新鮮配制的80％乙醇，靜置30s，待溶液澄清后棄上清，重復(fù)兩次，蓋上管蓋，瞬時(shí)離心，將殘留乙醇離心至管底，將八連管置于磁力架上，用10μl移液器吸去殘余乙醇，室溫靜置3min，將管從磁力架上取下，加入53μl的nuclease-free?water，吸打或渦旋混勻，室溫靜置2min，再將管置于磁力架上3min，待溶液澄清，吸取50μl上清液，轉(zhuǎn)移到新的pcr管或八連管中，得到dna與cdna混合物；
7、步驟五：片段化，將fea?enzyme?mix?v3取出，解凍并混勻、短暫離心收集至管底，置于冰上備用，將滅菌pcr管置于冰上，取10μl的fea?enzyme?mix?v3和dna與cdna混合物于滅菌pcr管中，混勻、離心，將反應(yīng)液收集至管底，再將滅菌pcr管置于pcr儀中，運(yùn)行程序，得到產(chǎn)物c；
8、步驟六：接頭連接，將rapid?ligation?buffer?v3、rapid?dna?ligase?v3分別取出于管中，解凍后混勻，短暫離心收集至管底，置于冰上備用，將pcr管放置于冰上，取30μl的rapid?ligation?buffer?v3、5μl的rapid?dna?ligase?v3、5μl的adapter、產(chǎn)物c于pcr管中，混勻后，離心將反應(yīng)液收集至管底，再將滅菌pcr管置于pcr儀中，運(yùn)行程序，得到產(chǎn)物d；
9、步驟七：連接后純化，取80μl磁珠于八連管中，加入產(chǎn)物d，混勻后，室溫靜置5min，瞬時(shí)離心，置于磁力架上靜置2-6min，待液體澄清后棄上清液，再加入180μl新鮮配制的80％乙醇，靜置30s，待溶液澄清后棄上清，重復(fù)兩次，蓋上管蓋，瞬時(shí)離心，將殘留乙醇離心至管底，將八連管置于磁力架上，用10μl移液器吸去殘余乙醇，室溫靜置3min，再將管從磁力架上取下，加入22μl的nuclease-free?water，吸打或渦旋混勻，室溫靜置2min，再將管置于磁力架上3min，待溶液澄清，吸取20μl上清液，轉(zhuǎn)移到新的pcr管或八連管中，得到20μl的dna；
10、步驟八：特異性擴(kuò)增，室溫解凍所需試劑，上下顛倒混勻備用，在冰上放置pcr管，在管中加入20μl的dna、2μl的特異性引物、2μl的通用引物、6μl的5×vahts?rt?multi-pcrmix，混勻后瞬時(shí)離心，將pcr管放置于pcr儀上，運(yùn)行程序，得到產(chǎn)物e；
11、步驟九：特異性擴(kuò)增后純化，取50μl磁珠于八連管中，加入全部產(chǎn)物e，混勻后，室溫靜置5min，瞬時(shí)離心，置于磁力架上靜置2-6min，待液體澄清后棄上清液，再加入180μl新鮮配制的80％乙醇，靜置30s，待溶液澄清后棄上清，重復(fù)兩次，用10μl移液器吸去殘余乙醇，室溫靜置3min，加入20μl的nuclease-free?water，將八連管從磁力架取下，吸打或渦旋混勻，室溫靜置2min，瞬時(shí)離心，再將八連管置于磁力架上，待溶液澄清，吸取16μl上清液，轉(zhuǎn)移到新的pcr管或八連管中，標(biāo)記為產(chǎn)物f；
12、步驟十：postpcr擴(kuò)增，將pcr管放置于冰上，在pcr管中加入產(chǎn)物f、4μ的lindex、20μl的vahts?hifi?amplification?mix，混勻后瞬時(shí)離心，將pcr管放置于pcr儀上，運(yùn)行程序，得到產(chǎn)物m；
13、步驟十一：p本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種用于病原微生物的單端多重PCR建庫方法，其特征在于：它包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于病原微生物的單端多重PCR建庫方法，其特征在于：所述1st?Strand?Buffer、2nd?Strand?Buffer、Rapid?Ligation?Buffer?V3、Rapid?DNALigase?V3均保存與-20℃下。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于病原微生物的單端多重PCR建庫方法，其特征在于：所述步驟二中的PCR儀的程序?yàn)椋簾嵘w105℃，25℃運(yùn)行10min，42℃運(yùn)行10min，70℃運(yùn)行15min，最終保持在4℃。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于病原微生物的單端多重PCR建庫方法，其特征在于：所述步驟三中的PCR儀的程序?yàn)椋簾o熱蓋，16℃運(yùn)行60min，最終保持在4℃。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于病原微生物的單端多重PCR建庫方法，其特征在于：所述步驟五中的PCR儀的程序?yàn)椋簾嵘w105℃，30℃運(yùn)行5min，72℃運(yùn)行5min，最終保持在4℃。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于病原微
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于病原微生物的單端多重PCR建庫方法，其特征在于：所述步驟七中的PCR儀的程序?yàn)椋簾嵘w105℃，95℃運(yùn)行3min，95℃運(yùn)行30s，60℃運(yùn)行1min，72℃運(yùn)行1min，72℃運(yùn)行3min，最終保持在4℃。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于病原微生物的單端多重PCR建庫方法，其特征在于：所述步驟十中的PCR儀的程序?yàn)椋簾嵘w105℃，98℃運(yùn)行3min，98℃運(yùn)行30s，60℃運(yùn)行1min，72℃運(yùn)行30s，72℃運(yùn)行1min，最終保持在4℃。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種用于病原微生物的單端多重pcr建庫方法，其特征在于：它包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于病原微生物的單端多重pcr建庫方法，其特征在于：所述1st?strand?buffer、2nd?strand?buffer、rapid?ligation?buffer?v3、rapid?dnaligase?v3均保存與-20℃下。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于病原微生物的單端多重pcr建庫方法，其特征在于：所述步驟二中的pcr儀的程序?yàn)椋簾嵘w105℃，25℃運(yùn)行10min，42℃運(yùn)行10min，70℃運(yùn)行15min，最終保持在4℃。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于病原微生物的單端多重pcr建庫方法，其特征在于：所述步驟三中的pcr儀的程序?yàn)椋簾o熱蓋，16℃運(yùn)行60min，最終保持在4℃。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于病原微生物的單端多...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：史冬，王平，呂冰清，錢雨飛，李祥瑜，
申請(專利權(quán))人：上海奕檢智造生命科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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