【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物工程，具體涉及一種重組耐高溫脂肪酶pfhl、表達該酶的重組菌株及其應用。
技術介紹
1、脂肪酶(lipase,ec?3.1.1.3)是一種三酰基甘油酯水解酶，其主要作用是在油水界面催化長鏈甘油三酯水解為甘油二酯、甘油單酯、甘油和脂肪酸。除了能夠催化甘油酯類化合物的水解之外，脂肪酶還可以用于催化酯合成、酯交換、生物表面活性劑的合成、多肽合成、聚合物的合成以及藥物的合成等方面，具有催化多樣性和底物專一性等特征，在糧油生產、食品工業、造紙工業、日用化學工業、農業化學工業、洗滌劑工業以及藥物合成等許多領域得到廣泛應用。
2、脂肪酶在酶制劑中銷量第三，僅次于蛋白酶和淀粉酶。目前工業應用的脂肪酶主要來源于酵母和細菌，最適溫度和ph范圍多為35～45℃和6.5～8.0，適應中低溫和偏中性的應用環境。但中低溫脂肪酶在工業應用中存在一些普遍問題，如高溫或堿性等條件下易失活等，這在一定程度上限制了脂肪酶的工業應用。對于脂肪酸鏈長的水解特異性，目前已報道的絕大多數脂肪酶都是優先識別短鏈脂肪酸，僅有少數能催化長鏈脂肪酸發生反應，并且在實際生產過程中仍存在活性不高，熱穩定性欠佳，特異性不高等問題。且隨著微生物脂肪酶工業化應用的不斷發展，市場對脂肪酶制劑的各項性質和指標卻又提出了更高的要求，如對不同的最適溫度和ph值、較高的溫度穩定性和酸堿耐受性、理想的催化活性和反應專一性、非常規溶劑(有機溶劑、離子液體等)的耐受性等，因此仍然迫切需要挖掘及表征新型性能優良的脂肪酶制劑資源，使其能更好地滿足工業需求。
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1、針對現有技術中存在的一些不足，本專利技術提供了一種重組耐高溫脂肪酶pfhl、表達該酶的重組菌株及其應用；本專利技術對脂肪酶基因進行密碼子優化，然后基于優化后的基因設計了用于大量特異性擴增脂肪酶的引物，并構建了表達該酶的重組菌株，誘導表達，得到重組耐高溫脂肪酶pfhl；所述重組耐高溫脂肪酶pfhl最適催化反應溫度為60℃，并且在50～80℃的溫度范圍下反應仍能保持80％的活性，在ph7.0～10.0的反應ph下反應仍能保持70％的活性；所述脂肪酶還具對中長鏈脂肪酸酯底物具有偏好特異性，利用脂肪酶水解甘油酯所產生的不同中長鏈脂肪酸具有不同的功能，具有很好的實用性。
2、為了實現上述技術目的，本專利技術采用以下技術手段：
3、本專利技術首先提供了一種重組耐高溫脂肪酶pfhl，所述重組耐高溫脂肪酶pfhl的氨基酸的序列如seq?id?no.2所示。
4、本專利技術還提供了編碼上述重組耐高溫脂肪酶pfhl的基因pfhl，所述基因的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。
5、本專利技術還提供了擴增上述pfhl的特異性引物對，所述引物對為：
6、ccgcgcggcagccatatgaacatggatgccagcac(seq?id?no:3)；
7、ggtgctcgagttacaggcctttgcttttcaggc(seq?id?no:4)。
8、本專利技術還提供了一種重組質粒，所述重組質粒攜帶上述基因pfhl的核苷酸片段。
9、本專利技術還提供了一種重組菌株，所述重組菌株在宿主菌中導入上述重組質粒；優選地，所述宿主菌包括大腸桿菌。
10、本專利技術還提供了重組耐高溫脂肪酶pfhl在油脂改性、酯類合成、藥物合成和造紙中的應用。
11、優選地，重組耐高溫脂肪酶pfhl在應用時反應溫度條件為50～80℃，反應ph條件為7.0～10.0。
12、一種用于生產低熱量油脂的酶制劑，所述酶制劑包括上述重組耐高溫脂肪酶pfhl。
13、與現有技術相比，本專利技術的有益效果在于：
14、現有的微生物來源的天然脂肪酶僅僅具有35～45℃的最適反應溫度，本專利技術利用基因工程技術獲得一種重組耐高溫脂肪酶pfhl，所述重組耐高溫脂肪酶pfhl最適催化反應溫度為60℃，并且在50～80℃的溫度范圍下反應仍能保持80％的活性，在ph7.0～10.0的反應ph下反應仍能保持70％的活性。本專利技術所述重組耐高溫脂肪酶pfhl具有耐高溫、ph作用范圍廣等突出優點，在各種工業領域將具有巨大的市場前景，更是對補充工業化生產應用的耐高溫性脂肪酶種類具有重要意義，能更好的滿足生產需求。
15、本專利技術制備所得的重組耐高溫脂肪酶pfhl在高溫條件下具有良好的穩定性，本專利技術的重組耐高溫脂肪酶pfhl在50～70℃下孵育2h內殘余酶活均保持在70％以上，在最適反應溫度為60℃下孵育2h內殘余酶活可保持在85％以上，具有良好的溫度穩定性。此特性可廣泛應用于在油脂改性、生物柴油、洗滌劑及造紙等工業領域，以解決在實際應用過程中溫度對酶催化反應的限制問題，降低工業應用成本。如，在一些酯合成過程中，例如在催化合成一些植物甾醇酯、棕櫚酸酯、維生素酯和香豆酸單萜酯等都需要在較高的溫度下進行酯化反應，以獲得其最大轉化率；在生產環保型的生物基增塑劑時也需要脂肪酶作為催化劑，一般的反應溫度在50-60℃；另外在造紙工業中，脂肪酶用于廢紙脫墨時的碎漿溫度和浮選溫度一般在50-65℃，因此也需要脂肪酶具有耐熱的特性；并且脂肪酶在加工過程中，在高溫制粒、烘干等過程中會造成酶活損失，部分熱穩定性差的脂肪酶活損失率高達80％以上。同時，在運輸、儲備等過程也需要酶制劑有足夠的穩定性。因此本專利技術的重組耐高溫脂肪酶能有效的降低工業生產成本，在高溫下依然保持較強穩定性。
16、本專利技術所本專利技術制備所得的重組耐高溫脂肪酶pfhl還具對中長鏈脂肪酸酯底物具有偏好特異性，利用脂肪酶水解甘油酯所產生的不同中長鏈脂肪酸具有不同的功能。中鏈脂肪酸可以廣泛應用于醫藥、保健食用油及養殖業；長鏈飽和脂肪酸如棕櫚酸和硬脂酸，主要用于生產作為乳化劑的脂肪酸鹽；長鏈不飽和脂肪酸在代謝中具有廣泛的生理活性，用于健康保健等，因此本專利技術制備的脂肪酶在食品、醫藥、保健及飼料工業等多個領域也具有良好的應用價值。
17、本專利技術技術方案中，所用的大腸桿菌表達菌株具有高水平的重組蛋白表達能力，表達水平高，發酵產酶條件溫和，培養基來源廣泛，發酵生產成本低，具有可持續發展的特點，對實際生產應用具有很好的推動作用。
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1.一種重組耐高溫脂肪酶PFHL，其特征在于，所述重組耐高溫脂肪酶PFHL的氨基酸的序列如SEQ?ID?NO.2所示。
2.編碼權利要求1重組耐高溫脂肪酶PFHL的基因Pfhl，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。
3.擴增權利要求2所述的Pfhl的特異性引物對，其特征在于，所述引物對為：
4.一種重組質粒，其特征在于，所述重組質粒攜帶權利要求2所述的基因Pfhl的核苷酸片段。
5.一種重組菌株，其特征在于，所述重組菌株在宿主菌中導入權利要求4所述的重組質粒。
6.根據權利要求5所述的重組菌株，其特征在于，所述宿主菌包括大腸桿菌。
7.權利要求1所述的重組耐高溫脂肪酶PFHL在油脂改性、酯類合成、藥物合成和造紙中的應用。
8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于，重組耐高溫脂肪酶PFHL在應用時反應溫度條件為50～80℃，反應pH條件為7.0～10.0。
9.一種酶制劑，其特征在于，所述酶制劑包括權利要求1所述的重組耐高溫脂肪酶PFHL。
【技術特征摘要】
1.一種重組耐高溫脂肪酶pfhl，其特征在于，所述重組耐高溫脂肪酶pfhl的氨基酸的序列如seq?id?no.2所示。
2.編碼權利要求1重組耐高溫脂肪酶pfhl的基因pfhl，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。
3.擴增權利要求2所述的pfhl的特異性引物對，其特征在于，所述引物對為：
4.一種重組質粒，其特征在于，所述重組質粒攜帶權利要求2所述的基因pfhl的核苷酸片段。
5.一種重組菌株，其特征在于，...
【專利技術屬性】
技術研發人員：齊向輝，王瓊，趙梅，員君華，張國艷，張宇飛，
申請(專利權)人：江蘇大學，
類型：發明
國別省市：
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