【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及微生物，尤其涉及一種高效轉化高純度稀有人參皂苷ck的復合酶及其制備方法與應用。
技術介紹
1、稀有人參皂苷compound?k(ck)，是非天然人參皂苷，主要由其他二醇型人參皂苷轉化而來，具有良好的生物活性，包括抗腫瘤、抗皮膚衰老、抗過敏和抗炎等，用途廣泛、經濟效益高。
2、目前，制備人參皂苷ck的方法主要有微生物發酵法和酶解法。專利cn106047978a是以微生物發酵法制備得到人參皂苷ck，該專利以紫芝為發酵菌進行發酵培養，在發酵至少3天后添加天然皂苷至發酵液中，持續發酵得到稀有人參皂苷ck，發酵6天稀有人參皂苷ck產量最高，平均可以達到11.415mg/ml。盡管該方法能夠在實驗室中得到產量較高的人參皂苷ck，但是在工業生產中，存在與之相配套、可行的生產設備，無法實現人參皂苷ck的大批量生產。
3、專利cn105296587b是以酶解法制備得到人參皂苷ck，以雙歧桿菌產生的β-葡萄糖苷酶與濃度為10mg/ml人參皂苷rb1反應生成人參皂苷ck，人參皂苷ck的轉化效率為62-68％，然而，該專利的底物濃度為1％(10mg/ml)，不符合工業化生產的要求。在工業化生產中，底物濃度若低于10％會導致轉化后生產的人參皂苷ck由于濃度過低，在反應釜中加熱、攪拌，以及后續純化、萃取、旋蒸等處理步驟中都會導致人參皂苷ck造成大量損失，同時消耗大量電能，使得生產成本大幅提高。與此同時，大部分β-葡萄糖苷酶的在微生物中的表達量低、穩定性差，只能在底物濃度低的情況下進行酶解，一旦底物濃度升高則酶的濃度和活
4、專利cn?108138212?b是以酶解法制備得到人參皂苷ck，以棘孢曲霉和里氏木霉菌產生的果膠酶與人參精制皂苷反應生產人參皂苷ck，對酶解液進行加熱使酶失活、加入乙酸乙酯提取，并采用硅膠柱色譜法分離得到人參皂苷ck。該方法采用多種有機溶劑以及生產工藝繁多，對環境造成負擔、生產成本高。
技術實現思路
1、本專利技術的目的在于克服現有技術的不足之處而提供一種高效轉化高純度稀有人參皂苷ck的復合酶及其制備方法與應用。本專利技術還提供了一種高效轉化高純度稀有人參皂苷ck的方法，能夠提高人參皂苷rb1轉化為人參皂苷ck的轉化率，適合工業化生產，所制備得到的人參皂苷ck具有電導率低、穩定性好的優點。
2、為實現上述目的，本專利技術采取的技術方案為：
3、第一方面，本專利技術提供了一種β-葡萄糖苷酶的制備方法，所述制備方法包括以下步驟：
4、a1、對來源于土壤中華單胞菌的β-葡萄糖苷酶進行密碼子優化，通過基因編輯技術制備得到帶有編碼序列的表達載體，所述密碼子優化后的β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列如seq?id?no.1所示；
5、a2、將步驟a1所述表達載體轉化至大腸桿菌中，通過篩選及鑒定得到陽性克隆；
6、a3、將步驟a2所得陽性克隆制備為二級種子液，利用二級種子液進行分批補料發酵，得到發酵液；
7、a4、對步驟a3所得發酵液進行離心，收集菌體沉淀，對所得菌體沉淀進行破碎、離心、濃縮和凍干處理，得到β-葡萄糖苷酶。
8、本專利技術復合酶所采用的β-葡萄糖苷酶由專利技術人自行生產獲得。人參皂苷酶解轉化途徑為：rb1→rd→f2→ck，不同的酶具有不同的限速位點。如商業復合酶的限速位點為f2，導致大量原料聚集在f2→ck階段，從而降低了ck的整體轉化率；而本專利技術自產的β-葡萄糖苷酶，是在商業酶的缺點基礎上，通過計算機軟件輔助設計、定向優化制備得到的特殊ck轉化酶，它的限速位點在rd→f2階段。將該β-葡萄糖苷酶與其他酶進行互補使用，能有效避免所有限速位點的影響，實現稀有人參皂苷ck的高效轉化。目前本專利技術自產的β-葡萄糖苷酶，通過發酵工藝的優化，所得到的成品酶活可達到12000u/g及以上，是實現對傳統商業酶有效補充的關鍵。
9、作為本專利技術所述制備方法的優選實施方式，在步驟a3中，所述分批補料發酵包括以下操作：
10、b1、將二級種子液接種至發酵培養基中，調節ph＝6.6-7.0，溫度設置為35-37℃；所述二級種子液與發酵培養基的體積比為二級種子液：發酵培養基＝(0.8-1):30；
11、b2、當溶氧下降至60-70％時，調溫至23-27℃并開始補料，第一小時補料速度190-200ml/h，第二小時補料速度220-230ml/h，第三小時補料速度250-260ml/h并維持不變；通過控制罐壓，轉速，通空氣量以控制溶氧慢慢下降至12-18％；補料后每4h取樣檢測發酵液的od600值，當od600值不再上升時結束發酵。
12、作為本專利技術所述制備方法的優選實施方式，在步驟b1中，所述發酵培養基的配方為：酵母浸粉10g/l、檸檬酸1g/l、磷酸二氫鉀6g/l、硫酸銨5g/l、七水硫酸鎂1g/l、磷酸氫二鉀16g/l、蛋白胨8g/l、復配維生素0.1g/l、葡萄糖7g/l，接種前按發酵液體積添加卡那霉素至終濃度為20μg/ml。
13、作為本專利技術所述制備方法的優選實施方式，在步驟b2中，所述補料為20wt％滅菌乳糖溶液。
14、第二方面，本專利技術提供了一種β-葡萄糖苷酶，主要由上述制備方法制備得到。
15、第三方面，本專利技術提供了一種高效轉化高純度稀有人參皂苷ck的復合酶，包括β-葡萄糖苷酶、果糖基轉移酶、乳糖酶、纖維素酶和β-葡聚糖酶，所述β-葡萄糖苷酶、果糖基轉移酶、乳糖酶、纖維素酶和β-葡聚糖酶的重量比為β-葡萄糖苷酶：果糖基轉移酶：乳糖酶：纖維素酶：β-葡聚糖酶＝(0.05-0.2)：(0.005-0.2)：(0.01-0.1)：(0.01-0.1)：(0.02-0.1)；
16、所述β-葡萄糖苷酶為上述β-葡萄糖苷酶。
17、本專利技術通過選取β-葡萄糖苷酶、果糖基轉移酶、乳糖酶、纖維素酶和β-葡聚糖酶搭配得到復合酶，能夠在酶工程工藝中制備人參皂苷ck，具有協同增效將人參皂苷rb1轉化為人參皂苷ck的轉化率提高的作用，并且人參皂苷ck的含量最高可達69.3％。
18、發酵工藝的痛點之一是微生物的生長狀態難以控制，造成發酵水平在不同批次間浮動較大，導致稀有人參皂苷ck產量不恒定。同時，微生物發酵技術需要添加碳源、氮源增加了人參皂苷提取時的雜質含量，造成產品的不穩定。本專利技術通過復合酶技術，有效轉化人參皂苷為稀有人參皂苷ck，同時酶的活性、濃度等參數能夠精準控制，使得批次間人參皂苷ck的性質高度重復，提高了生產工藝的穩定性。
19、作為本專利技術所述復合酶的優選實施方式，所述β-葡萄糖苷酶、果糖基轉移酶、乳糖酶、纖維素酶和β-葡聚糖酶的重量比為β-葡萄糖苷酶：果糖基轉移酶：乳糖酶：纖維素酶：β-葡聚糖酶＝0.1：0.01：0.04：0.05：0.05。
20、在優選重量比下，本專利技術復合酶的人參皂苷ck轉化效率更高。
21、作為本專利技術所述復本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種β-葡萄糖苷酶的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括以下步驟：
2.如權利要求1所述β-葡萄糖苷酶的制備方法，其特征在于，在步驟A3中，所述分批補料發酵包括以下操作：
3.一種β-葡萄糖苷酶，其特征在于，主要由權利要求1或2所述制備方法制備得到。
4.一種高效轉化高純度稀有人參皂苷CK的復合酶，其特征在于，包括β-葡萄糖苷酶、果糖基轉移酶、乳糖酶、纖維素酶和β-葡聚糖酶，所述β-葡萄糖苷酶、果糖基轉移酶、乳糖酶、纖維素酶和β-葡聚糖酶的重量比為β-葡萄糖苷酶：果糖基轉移酶：乳糖酶：纖維素酶：β-葡聚糖酶＝(0.05-0.2)：(0.005-0.2)：(0.01-0.1)：(0.01-0.1)：(0.02-0.1)；
5.如權利要求4所述的復合酶，其特征在于，所述β-葡萄糖苷酶、果糖基轉移酶、乳糖酶、纖維素酶和β-葡聚糖酶的重量比為β-葡萄糖苷酶：果糖基轉移酶：乳糖酶：纖維素酶：β-葡聚糖酶＝0.1：0.01：0.04：0.05：0.05。
6.如權利要求4或5所述的復合酶，其特征在于，所述β-葡萄糖苷酶的酶活力
7.如權利要求4-6任一項所述的復合酶在制備人參皂苷CK中的應用。
8.一種高效轉化高純度稀有人參皂苷CK的方法，其特征在于，包括以下步驟：
9.如權利要求8所述的方法，其特征在于，包括如下(Ⅰ)-(Ⅲ)中的至少一種：
10.如權利要求9所述的方法，其特征在于，包括如下(Ⅳ)-(Ⅴ)中的至少一種：
...【技術特征摘要】
1.一種β-葡萄糖苷酶的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括以下步驟：
2.如權利要求1所述β-葡萄糖苷酶的制備方法，其特征在于，在步驟a3中，所述分批補料發酵包括以下操作：
3.一種β-葡萄糖苷酶，其特征在于，主要由權利要求1或2所述制備方法制備得到。
4.一種高效轉化高純度稀有人參皂苷ck的復合酶，其特征在于，包括β-葡萄糖苷酶、果糖基轉移酶、乳糖酶、纖維素酶和β-葡聚糖酶，所述β-葡萄糖苷酶、果糖基轉移酶、乳糖酶、纖維素酶和β-葡聚糖酶的重量比為β-葡萄糖苷酶：果糖基轉移酶：乳糖酶：纖維素酶：β-葡聚糖酶＝(0.05-0.2)：(0.005-0.2)：(0.01-0.1)：(0.01-0.1)：(0.02-0.1)；
5.如權利要求4所述的復合酶，其特征在于，所述β-葡萄糖苷酶、果糖基轉移酶、乳糖酶、纖維素酶和β-葡聚糖酶...
【專利技術屬性】
技術研發人員：吳學明，侯森，童夢西，李安章，
申請(專利權)人：廣州梵之容化妝品有限公司，
類型：發明
國別省市：
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