【技術實現步驟摘要】
1.本文件涉及用于控制配體門控離子通道(lgic)活性的材料和方法。例如，本文件提供了經修飾的lgic，其包含至少一個lgic亞基，所述lgic亞基具有經修飾的配體結合域(lbd)和/或經修飾的離子孔域(ipd)。還提供了外源lgic配體，其可以結合并激活經修飾的lgic。在一些情況下，經修飾的lgic和外源配體可以用于治療患有通道病(channelopathy)的哺乳動物(例如，神經通道病或肌肉通道病)。在一些情況下，經修飾的lgic和外源lgic配體可以用于調控(例如，激活或抑制)穿過哺乳動物細胞膜的離子轉運。在一些情況下，經修飾的lgic和外源lgic配體可以用于調控(例如，增加或降低)哺乳動物中細胞的興奮性。2.背景資料離子通道介導細胞中的離子通量，這極大地影響它們的生物學功能。這點的一個突出的實例是神經元，其中離子通道控制神經元之間的電信號傳導，以影響生理學、感覺、行為、情緒和認知。不同的lgic具有不同的配體結合特性以及特定的離子電導特性(hille?2001?ionchannels?of?excitable?membranes.pp.814.sunderland，ma：sinauer?associates；kandel?et?al?2000?principles?of?neural?science.usa：mcgraw-hill?co.1414pp)。例如，煙堿乙酰膽堿受體(nachrs)結合內源配體乙酰膽堿(ach)，其激活陽離子的電導并且通常使細胞去極化，從而增加細胞興奮性。相反，甘氨酸受體(glyr)結合內源配體甘氨酸，其激活氯離子
技術介紹
0、專利技術背景
技術實現思路
1、內源lgic激動劑如ach的水平不易控制。
2、本文件提供了用于控制lgic活性(例如，增加lgic對外源配體的敏感性和/或降低對內源配體如ach的敏感性)的材料和方法。例如，本文件提供了經修飾的lgic，其包含至少一個經修飾的lgic亞基，所述經修飾的lgic亞基具有lbd和ipd，并且具有至少一個經修飾的氨基酸(例如，氨基酸取代)。還提供了外源lgic配體，其可以結合并激活經修飾的lgic。在一些情況下，經修飾的lgic和外源配體可以用于治療患有通道病(例如，神經通道病或肌肉通道病)的哺乳動物。在一些情況下，經修飾的lgic和外源lgic配體可以用于調控(例如，激活或抑制)穿過哺乳動物細胞膜的離子轉運。在一些情況下，經修飾的lgic和外源lgic配體可以用于調控(例如，增加或降低)哺乳動物中細胞的興奮性。
3、具有控制lgic活性的能力提供了實現細胞中離子轉運控制的獨特且未實現的機會。例如，對一種或多種外源lgic配體具有增加的敏感性的經修飾的lgic可以用于基于外源lgic配體的遞送提供離子轉運和/或細胞興奮性的時間和空間控制。例如，對內源lgic配體具有降低的敏感性的經修飾的lgic阻止經修飾的lgic的不希望的激活，并且允許通過外源配體選擇性控制經修飾的lgic。此外，對經修飾的lgic具有增加的效力的外源lgic配體相對于內源離子通道改善經修飾的lgic的靶向選擇性。因此，本文提供的經修飾的lcig和外源lgic配體可用于在減少小分子對非意圖靶標的副作用的情況下實現治療效果。
4、如本文所述，經修飾的lgic中的一個或多個突變可以增強外源lgic配體的效力。相對于α7-glyr，殘基l131處α7-glyr的α7lbd的突變(例如用gly或ala取代leu)增加伐倫克林(varenicline)(16倍)和托烷司瓊(tropisetron)(3.6倍)的效力，而降低ach效力(-6.4倍)。在殘基g175(例如g175k)或p216(例如p216i)處α7-glyr的α7lbd的突變增強ach、尼古丁、托烷司瓊、伐倫克林以及其他喹核堿和莨菪烷激動劑的效力。將殘基g175k處的突變與降低內源激動劑ach的效力的突變(例如y115f)組合產生對托烷司瓊具有增加的效力(5.5倍)并且對ach具有降低的效力(-8倍)的α7-glyr?y115f?g175k。此外，組合α7lbd中這些嵌合通道中殘基77(例如用phe或tyr取代trp)和/或79(例如用gly、ala或ser取代gln)和/或131(例如用gly或ala取代leu)和/或141(例如用phe或pro取代leu)處的突變與殘基g175(例如g175k)或p216(例如p216i)處的效力增強突變增加獨特配體的效力和/或降低ach效力。例如，含有具有殘基79處的突變(例如用gly取代gln)、殘基115處的突變(例如用phe取代tyr)、和殘基175處的突變(例如用lys取代gly)的α7?nachr?lbd(α7?lbd)的嵌合α7-glyrlgic相對于未修飾的嵌合α7-glyr?lgic具有對外源莨菪烷lgic配體化合物723(莨菪烷)的大于100倍增加的敏感性和降低的ach敏感性(-15倍)。此外，經修飾的lgic對外源lgic配體，諸如喹核堿或莨菪烷具有幾乎20倍增加的敏感性，所述經修飾的lgic包含至少一個嵌合lgic亞基，所述嵌合lgic亞基含有具有殘基79處的突變(例如用ala、gly或ser取代gln)的α7nachr?lbd(α7lbd)和具有殘基298處的突變(例如用gly取代ala)的glyr?ipd。α7lbd的殘基27(例如用asp取代arg)和41(例如用arg取代glu)處的另外的突變降低經修飾的嵌合lgic與未修飾的離子通道的結合。α7?lbd的殘基115(例如用phe取代tyr)、139(例如用gly或leu取代gln)、210(例如用phe取代tyr)、217(例如用phe取代tyr)、和/或219(例如用ala取代asp)處的另外的突變降低嵌合lgic對內源配體ach的敏感性。這些嵌合lgic允許對哺乳動物細胞中的細胞功能的高度選擇性控制，而使與哺乳動物中內源信號傳導系統的交叉響應性最小化。
5、一般而言，本文件的一方面的特征在于經修飾的lgic，其具有至少一個經修飾的lgic亞基，所述經修飾的lgic亞基包含具有氨基酸修飾的lbd和ipd，其中外源lgic配體激活經修飾的lgic。經修飾的lgic可以是嵌合lgic，其具有來自第一lgic的lbd和來自第二lgic的ipd。lbd可以是α7煙堿乙酰膽堿受體(α7-nachr)lbd。權利要求3的經修飾的lgic，其中α7-nachr?lbd中的至少一個經修飾的氨基酸包含選自下組的氨基酸殘基處的氨基酸取代：α7-nachr?lbd的殘基77、79、131、139、141、175、和216。氨基酸取代可以在α7lbd的殘基79處，并且氨基酸取代可以是q79a、q79g或q79s。例如，α7lbd的殘基79處的氨基酸取代可以是q79g。ipd可以是血清素3受體(5ht3)ipd、甘氨酸受體(glyr)ipd、γ-氨基丁酸本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.核酸，其編碼經修飾的α7-煙堿乙酰膽堿受體(α7-nAChR)配體結合域(LBD)，其中所述經修飾的α7-nAChR?LBD由以下組成：SEQ?ID?NO:2的具有(a)L131G氨基酸取代；(b)L131G氨基酸取代和Q139L氨基酸取代；(c)L131G氨基酸取代和Y217F氨基酸取代；或(d)L131G氨基酸取代、Q139L氨基酸取代和Y217F氨基酸取代的氨基酸。
2.核酸，其編碼至少一個經修飾的配體門控離子通道(LGIC)亞基，所述至少一個經修飾的LGIC亞基包含權利要求1的經修飾的α7-nAChR?LBD和離子孔域(IPD)。
3.核酸，其編碼經修飾的配體門控離子通道(LGIC)，所述經修飾的配體門控離子通道包含權利要求2的至少一個經修飾的LGIC亞基。
4.權利要求2或3的核酸，其中所述離子孔域(IPD)是血清素3受體(5HT3)IPD。
5.權利要求2或3的核酸，其中所述離子孔域(IPD)是γ-氨基丁酸(GABA)受體IPD。
6.權利要求2或3的核酸，其中所述離子孔域(IPD)是α7-煙堿乙酰膽堿受
7.權利要求1-6中任一項的核酸，其中所述經修飾的α7-nAChR?LBD具有L131G氨基酸取代。
8.權利要求1-6中任一項的核酸，其中所述經修飾的α7-nAChR?LBD具有L131G氨基酸取代和Q139L氨基酸取代。
9.權利要求1-6中任一項的核酸，其中所述經修飾的α7-nAChR?LBD具有L131G氨基酸取代和Y217F氨基酸取代。
10.權利要求1-6中任一項的核酸，其中所述經修飾的α7-nAChR?LBD具有L131G氨基酸取代、Q139L氨基酸取代和Y217F氨基酸取代。
11.權利要求1-10中任一項的核酸，其中所述經修飾的α7-nAChR?LBD進一步包含選自下組的一個或多個氨基酸殘基處的氨基酸取代：如SEQ?ID?NO:2中編號的殘基175、210、216和219。
12.權利要求11的核酸，其中所述氨基酸取代位于
13.權利要求3-12中任一項的核酸，其中外源配體選擇性結合并且激活所述經修飾的LGIC，并且相對于缺乏所述經修飾的LGIC亞基的LGIC，所述經修飾的LGIC具有降低的用內源性乙酰膽堿(ACh)的激活效力。
14.權利要求13的核酸，其中所述經修飾的LGIC對Ach具有>20μM的EC50。
15.權利要求13的核酸，其中所述降低的用Ach的激活效力相對于缺乏所述經修飾的LGIC亞基的LGIC至少降低3倍。
16.權利要求13-15中任一項的核酸，其中所述外源配體是選自下組的合成的外源LGIC配體：喹核堿、莨菪烷、9-氮雜二環[3.3.1]壬烷、6,7,8,9-四氫-6,10-亞甲基-6H-吡嗪并(2,3-h)苯丙氮卓和1,4-二氮雜二環[3.2.2]壬烷。
17.權利要求16的核酸，其中所述合成的外源LGIC配體是：
18.哺乳動物細胞，其包含權利要求1-17中任一項的核酸。
19.病毒載體，其包含權利要求1-17中任一項的核酸。
20.權利要求19的病毒載體，其中所述病毒載體是腺相關病毒載體。
21.權利要求3-17中任一項的核酸或權利要求19或20的病毒載體在制備用于治療哺乳動物中的通道病的藥物中的用途，其中該藥物用于方法中，所述方法包括：
22.權利要求21的用途，其中所述通道病選自下組：巴特綜合征、Brugada綜合征、兒茶酚胺依賴性室性心動過速(CPVT)、先天性高胰島素血癥、囊性纖維化、Dravet綜合征、發作性共濟失調、紅斑性肢痛病、全身型癲癇(例如伴有熱性癲癇發作)、家族性偏癱性偏頭痛、纖維肌痛、高鉀性周期性麻痹、低鉀性周期性麻痹、蘭伯特肌無力綜合征、長QT綜合征(如羅馬諾-沃德綜合征)、短QT綜合征、惡性高熱、粘脂貯積癥IV型、重癥肌無力、先天性肌強直、視神經脊髓炎、神經性肌強直、非綜合征性耳聾、先天性副肌強直、色素性視網膜炎、蒂莫西綜合征(timothy?syndrome)、耳鳴、癲癇發作(seizure)、三叉神經痛和多發性硬化。
23.權利要求3-17中任一項的核酸或權利要求19或20的病毒載體在制備用于調節穿過哺乳動物細胞膜的離子轉運的藥物中的用途，其中所述藥物用于方法中，所述方法包括：
24.權利要求23的用途，其中所述調節包括激活離子轉運。
25.權利要求23的用途，其中所述調節包括抑制離子轉運。
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【技術特征摘要】
1.核酸，其編碼經修飾的α7-煙堿乙酰膽堿受體(α7-nachr)配體結合域(lbd)，其中所述經修飾的α7-nachr?lbd由以下組成：seq?id?no:2的具有(a)l131g氨基酸取代；(b)l131g氨基酸取代和q139l氨基酸取代；(c)l131g氨基酸取代和y217f氨基酸取代；或(d)l131g氨基酸取代、q139l氨基酸取代和y217f氨基酸取代的氨基酸。
2.核酸，其編碼至少一個經修飾的配體門控離子通道(lgic)亞基，所述至少一個經修飾的lgic亞基包含權利要求1的經修飾的α7-nachr?lbd和離子孔域(ipd)。
3.核酸，其編碼經修飾的配體門控離子通道(lgic)，所述經修飾的配體門控離子通道包含權利要求2的至少一個經修飾的lgic亞基。
4.權利要求2或3的核酸，其中所述離子孔域(ipd)是血清素3受體(5ht3)ipd。
5.權利要求2或3的核酸，其中所述離子孔域(ipd)是γ-氨基丁酸(gaba)受體ipd。
6.權利要求2或3的核酸，其中所述離子孔域(ipd)是α7-煙堿乙酰膽堿受體(α7-nachr)ipd。
7.權利要求1-6中任一項的核酸，其中所述經修飾的α7-nachr?lbd具有l131g氨基酸取代。
8.權利要求1-6中任一項的核酸，其中所述經修飾的α7-nachr?lbd具有l131g氨基酸取代和q139l氨基酸取代。
9.權利要求1-6中任一項的核酸，其中所述經修飾的α7-nachr?lbd具有l131g氨基酸取代和y217f氨基酸取代。
10.權利要求1-6中任一項的核酸，其中所述經修飾的α7-nachr?lbd具有l131g氨基酸取代、q139l氨基酸取代和y217f氨基酸取代。
11.權利要求1-10中任一項的核酸，其中所述經修飾的α7-nachr?lbd進一步包含選自下組的一個或多個氨基酸殘基處的氨基酸取代：如seq?id?no:2中編號的殘基175、210、216和219。
12.權利要求11的核酸，其中所述氨基酸取代位于
13.權利要求3-12中任一項的核酸，其中外源配體選擇性結合并且激活所述經修飾的lgic，并且相對于缺乏所述經修飾的lgic亞基的lgic，所述經修飾的lgic具有降低的用內源性乙酰膽堿(ach)的激活效力。
14.權利要求13的核酸，其中所述經修飾的lgic對ach具有>20μm的ec50。
15.權利要求13的核酸，其中所述降低的用ach的激活效力相對于缺乏所述經修飾的lgic亞基的lgic至少降低3倍。
16.權利要求13-15中任一項的核酸，其中所述外源配體是選自下組的合成的外源lgic配體：喹核堿、莨菪烷、9-氮雜二環[3.3.1]壬烷、6,7,8,9-四氫-6,10-亞甲基-6h-吡嗪并(2,3-h)苯丙氮卓和1,4-二氮雜二環[3.2.2]壬烷。
17.權利要求16的核酸，其中所述合成的外源lgic配體是：
18.哺乳動物細胞，其包含權利要求1-17中任一項的核酸。
19.病毒載體，其包含權利要求1-17中任一項的核酸。
20.權利要求19的病毒載體，其中所述病毒載體是腺相關病毒載體。
【專利技術屬性】
技術研發人員：S·斯特恩森，P·李，C·馬格努斯，
申請(專利權)人：霍華休斯醫學研究院，
類型：發明
國別省市：
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