【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及基因測序，具體為一種基于修飾tn5的甲基化目標區域捕獲測序文庫的構建方法及其應用。
技術介紹
1、dna甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾，通過dna甲基轉移酶在特定堿基上選擇性地添加甲基，從而形成5-甲基胞嘧啶(5-mc)和其他少量的甲基化結構。這種化學修飾可以在不改變dna序列的情況下改變遺傳表現，在維持正常細胞功能、染色質結構修飾、胚胎發育以及人類腫瘤發生中發揮著重要作用。不同細胞類型和組織中的dna甲基化水平具有一定差異，這種差異可以影響基因的表達和功能。因此，研究人員通過整合dna甲基化與其他組學內容，以期揭示疾病發生的分子機制，并發現潛在的早篩標志物。
2、近年來，各類癌癥對于人類健康的威脅程度愈發嚴重。與正常細胞相比，癌細胞的基因組甲基化水平整體偏低，但其基因的啟動子區域呈現出高甲基化趨勢。人類基因組研究指出，腫瘤抑制基因啟動子區域的高甲基化水平能夠通過改變染色質結構、dna構象及dna-蛋白質互作方式來抑制抑癌基因的表達，細胞失去抑癌功能后會重新進入生長周期，最終導致腫瘤的形成。
3、現階段，人們往往通過檢測某些癌細胞或組織中特征性甲基化結構的改變來預防腫瘤的發生。dna甲基化研究的主要方法包括亞硫酸氫鹽測序法、限制性內切酶測序法以及親和富集法等，其中亞硫酸氫鹽測序法是目前公認的dna甲基化測序“金標準”，由亞硫酸氫鹽處理過的dna，其基因組上未甲基化的c會轉化為胸腺嘧啶(t)，而甲基化的c保持不變，pcr擴增后對產物進行測序，比較測序結果與未處理序列即可確定dna序列中甲基化位
4、盡管全基因組亞硫酸氫鹽測序可以實現高分辨率且全面的甲基化模式檢測，但受制于文庫構建時的高起始量dna，部分樣本并不適用。
5、因此有必要設計一種甲基化捕獲測序文庫的構建方法，適用低起始量的dna的測序，并滿足甲基化捕獲的要求。
技術實現思路
1、本專利技術提供了一種基于修飾tn5的甲基化目標區域捕獲測序文庫的構建方法及其應用，以適用低起始量的dna的測序，并滿足甲基化捕獲的要求。
2、有鑒于此，本專利技術的方案為：
3、本專利技術的第一個方面在于，提出甲基化捕獲測序文庫的構建方法，步驟包括：
4、將帶有雙端標簽的測序接頭包埋進tn5轉座酶中組建tn5轉座子；
5、使用組建好的tn5轉座子分別對若干樣本基因組dna進行片段化，得到包含不同標簽的各樣本片段化產物；
6、對各樣本片段化產物進行末端補平與修復；
7、將修復后的各產物進行等量混合，加入封阻引物雜交；
8、產物進行轉化處理，將非甲基化的胞嘧啶轉化為尿嘧啶；
9、將轉化后的dna進行pcr擴增得到甲基化捕獲的測序文庫。
10、進一步地，所述測序接頭包括核苷酸序列如seq?id?no：1所示的第一接頭、核苷酸序列如seq?id?no：2所示的第二接頭，及核苷酸序列seq?id?no：3所示的第三接頭；第二接頭、第三接頭中的堿基c均甲基化修飾。
11、優選地，其特征在于，所述tn5轉座子組建過程使用第一引物和第二引物，引物中所有堿基c均甲基化修飾；第一引物選自核苷酸序列如seq?id?no：4-6所示的任意一種，第二引物選自核苷酸序列如seq?id?no：7-14所示的引物任意一種。
12、進一步地，所述樣品片段化后使用sds終止，隨后加入中和反應試劑，消除sds。
13、進一步地，所述片段化產物修復過程使用klenow酶、t4聚合酶以及四種堿基補平末端，然后用無3’-5’外切活性的klenow酶進行修復。
14、進一步地，所述雜交過程為，將混合后的修復產物濃縮成干粉后加入封阻引物、探針和雜交buffer后進行雜交，雜交完成后使用鏈霉親和素磁珠進行吸附并用洗脫試劑進行清洗，去除多余片段及冗余雜質。
15、進一步地，所述pcr擴增時加入核苷酸序列如seq?id?no：15-16所示的引物。
16、本專利技術的第二個方面在于，提出所述構建方法得到的甲基化捕獲測序文庫。
17、本專利技術的第三個方面在于，提出第二個方面所述甲基化捕獲測序文庫在非診斷為目的基因甲基化檢測中的應用。
18、本專利技術的第四個方面在于，提出一種測序方法，包括以下步驟：
19、根據第一個方面所述構建方法制備得到甲基化捕獲測序文庫；
20、對所述甲基化捕獲測序文庫進行測序，獲得測序數據；
21、將所述測序數據與參考基因組數據進行比對，根據比對信息及各文庫標簽獲得各樣本基因組dna的甲基化位點。
22、與現有技術相比，本專利技術具備以下有益效果：
23、本專利技術所述文庫構建方法基于tn5轉座子的轉座特性，直接將修飾的帶有雙端barcode的測序接頭包埋進tn5轉座酶中，形成一批帶有不同序列標簽的tn5轉座子；利用不同的tn5轉座子對多個樣本進行片段化可以使得不同樣本攜帶有不同的序列標簽，以達到區分樣本的目的，實現多個低起始量樣本的混合測序，極大地提高了實驗通量；相較于傳統的全基因組甲基化測序方法，本專利技術的優勢在于不需要任何復雜精密的儀器，常規實驗器材器即可完成所有操作，并且僅僅需要1天時間即可將低起始量樣本轉變為高質量的待測序樣品。
24、本專利技術可以處理dna起始量為500ng，甚至是400ng的樣品，對于dna總量較少的實驗樣品有著顯著優勢。此外，該方法需要的dna的起始量低，平均捕獲特異性超90％以上，call?rate達到99％。
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1.甲基化捕獲測序文庫的構建方法，其特征在于，步驟包括：
2.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，所述測序接頭包括核苷酸序列如SEQID?NO：1所示的第一接頭、核苷酸序列如SEQ?ID?NO：2所示的第二接頭，及核苷酸序列SEQID?NO：3所示的第三接頭；第二接頭、第三接頭中的堿基C均甲基化修飾。
3.根據權利要求2所述的構建方法，其特征在于，所述Tn5轉座子組建過程使用第一引物和第二引物，引物中所有堿基C均甲基化修飾；第一引物選自核苷酸序列如SEQ?ID?NO：4-6所示的任意一種，第二引物選自核苷酸序列如SEQ?ID?NO：7-14所示的引物任意一種。
4.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，所述樣品片段化后使用SDS終止，隨后加入中和反應試劑，消除SDS。
5.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，所述片段化產物修復過程使用Klenow酶、T4聚合酶以及四種堿基補平末端，然后用無3’-5’外切活性的Klenow酶進行修復。
6.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，所述雜交過程為，將混合后的
7.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，所述PCR擴增時加入核苷酸序列如SEQID?NO：15-16所示的引物。
8.權利要求1-7任意一項所述構建方法得到的甲基化捕獲測序文庫。
9.權利要求8所述甲基化捕獲測序文庫在非診斷為目的基因甲基化檢測中的應用。
10.一種測序方法，其特征在于，包括以下步驟：
...【技術特征摘要】
1.甲基化捕獲測序文庫的構建方法，其特征在于，步驟包括：
2.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，所述測序接頭包括核苷酸序列如seqid?no：1所示的第一接頭、核苷酸序列如seq?id?no：2所示的第二接頭，及核苷酸序列seqid?no：3所示的第三接頭；第二接頭、第三接頭中的堿基c均甲基化修飾。
3.根據權利要求2所述的構建方法，其特征在于，所述tn5轉座子組建過程使用第一引物和第二引物，引物中所有堿基c均甲基化修飾；第一引物選自核苷酸序列如seq?id?no：4-6所示的任意一種，第二引物選自核苷酸序列如seq?id?no：7-14所示的引物任意一種。
4.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，所述樣品片段化后使用sds終止，隨后加入中和反應試劑，消除sds。
5.根據權利要求...
【專利技術屬性】
技術研發人員：付亮亮，周鵬，王文斌，李新云，鄭竹清，
申請(專利權)人：華中農業大學，
類型：發明
國別省市：
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