【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及類器官領域，具體涉及胃癌類器官與胃癌相關肌成纖維細胞的共培養方法，還涉及利用共培養在化療藥物篩選中的應用。
技術介紹
1、
2、近年來，隨著細胞培養技術的改進，以干細胞驅動而自我組裝構建形成的類器官模型培養取得成功，特別是以人源腫瘤細胞構建的腫瘤類器官（patient-derived?tumororganoids，pdos）模型，因其能在體外重現腫瘤結構及其遺傳學特征而被廣泛應用于腫瘤生物學基礎研究及臨床精準治療等多個領域。然而，腫瘤微環境是由腫瘤細胞和間質細胞組成的復雜體系，常規的pdos僅包含了惡性腫瘤細胞，忽略了間質細胞對腫瘤細胞生長以及化療耐藥的影響。
3、癌癥相關成纖維細胞(cancer?associated?fibroblasts，cafs)作為腫瘤微環境中間質細胞的重要組成部分，其不僅參與支持腫瘤細胞的生長，而且介導腫瘤細胞的化療耐藥與免疫逃逸。目前，盡管在消化道腫瘤如結直腸癌的研究中已建立了cafs與pdos的共培養體系以探索cafs對pdos的影響，但關于胃癌患者來源的pdos與cafs的共培養仍鮮有研究。特別是腫瘤微環境中的cafs具有異質性，關于共培養體系中能夠影響pdos生物學功能的cafs屬于哪個細胞亞群尚未見相關報道。因此，構建胃癌cafs與pdos的共培養體系并明確其中cafs的具體細胞亞群屬性，有助于探索cafs亞群對pdos生長和耐藥的影響，有利于體外開展藥物的篩選及新藥研發。
技術實現思路
1、有鑒于此，本專
2、為達到上述目的，本專利技術提供如下技術方案：
3、1、胃癌類器官與胃癌相關肌成纖維細胞的共培養方法，將胃癌類器官單細胞懸液與胃癌相關肌成纖維細胞單細胞懸液按照數目比為1:1比例混合，然后加入基質膠，混勻后放入co2細胞培養箱使基質膠凝固，最后加入胃癌類器官培養基（biogeneous,?k2179-gc）培養。
4、本專利技術優選的，所述胃癌相關肌成纖維單細胞懸液的制備方法如下：取胃癌患者手術切除組織標本，用組織保存液保存，剪碎后加入腫瘤組織消化液1中進行消化，過濾收集濾網上組織小塊，隨后在co2細胞培養箱中貼壁培養，加入dmem完全培養基繼續培養，獲得胃癌相關成纖維細胞并進行鑒定，最后將鑒定獲得的胃癌相關肌成纖維細胞用胰蛋白酶消化，獲得單細胞懸液。
5、本專利技術優選的，所述加入腫瘤組織消化液1中進行消化是加入含有1mg/mlcollagenase?iv和100μg/ml?dnase?ⅰ的dmem培養基放入37℃恒溫搖床以轉速為14r/min進行消化，60min后終止消化。
6、本專利技術優選的，所述過濾是用70μm濾器過濾。
7、本專利技術優選的，所述用胰蛋白酶消化是加入胰蛋白酶至質量分數為0.25%，于37℃孵育1-2min，然后加入相當于胰蛋白酶體積3-5倍的dmem完全培養基終止消化。
8、本專利技術優選的，所述胃癌類器官單細胞懸液的制備方法如下：取胃癌患者手術切除組織標本，剪碎后加入腫瘤組織消化液2（biogeneous,?k601003）中進行消化至散落細胞團，加入dmem完全培養基終止消化，吹打組織消化液，40μm濾器過濾收集濾過液，將濾液離心收集沉淀，沉淀加入胃癌類器官培養基重懸，隨后加入bme基質膠混勻，放入co2細胞培養箱使基質膠凝固，加入胃癌類器官培養基進行培養，獲得胃癌類器官，將獲得的類器官消化成單細胞懸液。
9、本專利技術優選的，所述消化成單細胞懸液是將獲得的胃癌類器官用pbs清洗2遍，用0.1%bsa潤洗槍頭，加入tryple?express酶溶液輕柔吹打，放入co2細胞培養箱孵育消化，每隔5min取出觀察并輕柔吹打1次，直至大部分類器官消化成單細胞后加入相當于trypleexpress酶溶液5倍體積的advanced?dmem/f-12培養基終止消化，獲得類器官單細胞懸液。
10、本專利技術的有益效果在于：本專利技術提供了胃癌類器官與胃癌相關肌成纖維細胞的共培養方法，采用了含primocin抗生素的組織保存液運送組織，并采用含青霉素-鏈霉素的dmem培養基清洗組織，有效的地減少了組織處理過程中出現的微生物污染，同時組織全程都處在培養基的環境中，良好的維持了細胞在體外的活性，有利于提高成纖維細胞和類器官培養的成功率。
11、本專利技術還通過培養獲得的胃癌相關成纖維細胞，通過形態學和熒光抗體染色鑒定屬于肌成纖維細胞，明確了與胃癌類器官共培養的成纖維細胞的具體細胞亞群屬性。
12、本專利技術構建的人胃癌類器官與胃癌相關肌成纖維細胞共培養體系，采取的是類器官與成纖維細胞直接接觸培養的方式，近似模擬腫瘤細胞周圍的成纖維細胞浸潤，更好地反映了腫瘤微環境中成纖維細胞與腫瘤細胞間的相互作用。
13、本專利技術構建的人胃癌類器官與胃癌相關成纖維細胞共培養體系，可直接加入熒光染料hoechst和caspase3/7對細胞進行染色，直接觀察并量化胃癌類器官經藥物處理后的細胞活性。
14、本專利技術構建的共培養體系中胃癌類器官的生長速度更快，對化療藥物的抵抗性更強，更好地模擬了胃癌患者體內腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性，可成為腫瘤患者個體化治療藥物的篩選平臺。
本文檔來自技高網...【技術保護點】
1.胃癌類器官與胃癌相關肌成纖維細胞的共培養方法，其特征在于：將胃癌類器官單細胞懸液與胃癌相關肌成纖維細胞單細胞懸液按照數目比為1:1比例混合，然后加入基質膠，混勻后放入CO2細胞培養箱使基質膠凝固，最后加入胃癌類器官培養基培養。
2.根據權利要求1所述胃癌類器官與胃癌相關肌成纖維細胞的共培養方法，其特征在于，所述胃癌相關成肌纖維單細胞懸液的制備方法如下：取胃癌患者手術切除組織標本，用組織保存液保存，剪碎后加入腫瘤組織消化液1中進行消化，過濾收集濾網上組織小塊，隨后在CO2細胞培養箱中貼壁培養，加入DMEM完全培養基繼續培養，獲得胃癌相關成纖維細胞并進行鑒定，最后將鑒定獲得的胃癌相關肌成纖維細胞用胰蛋白酶消化，獲得單細胞懸液；
3.DMEM完全培養基：DMEM?basic基礎培養基、10%的胎牛血清、1％的Glutamax和1％的P/S、100IU青霉素和100ug/ml鏈霉素。
4.根據權利要求2所述胃癌類器官與胃癌相關肌成纖維細胞的共培養方法，其特征在于：所述加入腫瘤組織消化液1中進行消化是加入含有1mg/ml?Collagenase?IV
5.根據權利要求2所述胃癌類器官與胃癌相關肌成纖維細胞的共培養方法，其特征在于：所述過濾是用70μm濾器過濾。
6.根據權利要求2所述胃癌類器官與胃癌相關肌成纖維細胞的共培養方法，其特征在于：所述用胰蛋白酶消化是加入胰蛋白酶至質量分數為0.25%，于37℃孵育1-2min，然后加入相當于胰蛋白酶體積3-5倍的DMEM完全培養基終止消化。
7.根據權利要求1所述胃癌類器官與胃癌相關肌成纖維細胞的共培養方法，其特征在于：所述胃癌類器官單細胞懸液的制備方法如下：取胃癌患者手術切除組織標本，剪碎后加入bioGeneous腫瘤組織消化液中進行消化至散落細胞團，加入DMEM完全培養基，吹打組織消化液，40μm濾器過濾收集濾過液，將濾液離心收集沉淀，沉淀加入胃癌類器官培養基重懸，隨后加入BME基質膠混勻，放入CO2細胞培養箱使基質膠凝固，加入胃癌類器官培養基進行培養，獲得胃癌類器官，將獲得的類器官消化成單細胞懸液。
8.根據權利要求6所述胃癌類器官與胃癌相關肌成纖維細胞的共培養方法，其特征在于：所述消化成單細胞懸液是將獲得的胃癌類器官用PBS清洗2遍，用0.1%BSA潤洗槍頭，加入TrypLE?Express酶溶液輕柔吹打，放入CO2細胞培養箱孵育消化，每隔5min取出觀察并輕柔吹打1次，直至大部分類器官消化成單細胞后加入相當于TrypLE?Express酶溶液5倍體積的Advanced?DMEM/F-12培養基終止消化，獲得類器官單細胞懸液。
9.胃癌類器官與胃癌相關肌成纖維細胞的共培養用于化療藥物篩選中的應用。
...【技術特征摘要】
1.胃癌類器官與胃癌相關肌成纖維細胞的共培養方法，其特征在于：將胃癌類器官單細胞懸液與胃癌相關肌成纖維細胞單細胞懸液按照數目比為1:1比例混合，然后加入基質膠，混勻后放入co2細胞培養箱使基質膠凝固，最后加入胃癌類器官培養基培養。
2.根據權利要求1所述胃癌類器官與胃癌相關肌成纖維細胞的共培養方法，其特征在于，所述胃癌相關成肌纖維單細胞懸液的制備方法如下：取胃癌患者手術切除組織標本，用組織保存液保存，剪碎后加入腫瘤組織消化液1中進行消化，過濾收集濾網上組織小塊，隨后在co2細胞培養箱中貼壁培養，加入dmem完全培養基繼續培養，獲得胃癌相關成纖維細胞并進行鑒定，最后將鑒定獲得的胃癌相關肌成纖維細胞用胰蛋白酶消化，獲得單細胞懸液；
3.dmem完全培養基：dmem?basic基礎培養基、10%的胎牛血清、1％的glutamax和1％的p/s、100iu青霉素和100ug/ml鏈霉素。
4.根據權利要求2所述胃癌類器官與胃癌相關肌成纖維細胞的共培養方法，其特征在于：所述加入腫瘤組織消化液1中進行消化是加入含有1mg/ml?collagenase?iv和100μg/mldnase?ⅰ的dmem培養基放入37℃恒溫搖床以轉速為14r/min進行消化，60min后終止消化。
5.根據權利要求2所述胃癌類器官與胃癌相關肌成纖維細胞的共培養方法，其特征在于：所述過濾是用70μm濾器過濾。
【專利技術屬性】
技術研發人員：彭六生，張媛媛，段振銓，李雨賢，黃夢秋，朱寶行，孫紅武，鄒全明，
申請(專利權)人：中國人民解放軍陸軍軍醫大學，
類型：發明
國別省市：
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