【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本申請(qǐng)涉及生物，尤其涉及一種土曲霉啟動(dòng)子文庫及其篩選方法與應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、土曲霉是一種具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的工業(yè)絲狀真菌，在生產(chǎn)初級(jí)代謝產(chǎn)物和次級(jí)代謝產(chǎn)物上都表現(xiàn)出了極大潛力。同時(shí)在實(shí)際生產(chǎn)中還表現(xiàn)出發(fā)酵周期短、產(chǎn)孢能力強(qiáng)、抗逆性能好、發(fā)酵魯棒性強(qiáng)等良好的工業(yè)性能，已被應(yīng)用于衣康酸、洛伐他汀、反式烏頭酸和大黃素甲醚細(xì)胞工廠構(gòu)建并實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)。
2、隨著代謝工程和合成生物學(xué)的發(fā)展，相應(yīng)的多種方法已被開發(fā)用于微生物高滴度生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)物，其中啟動(dòng)子工程已成為調(diào)控基因表達(dá)并優(yōu)化目標(biāo)產(chǎn)物生物合成途徑的關(guān)鍵技術(shù)，并廣泛應(yīng)用于微生物的代謝工程改造。啟動(dòng)子是調(diào)控基因表達(dá)的重要元件，其位于結(jié)構(gòu)基因5’端上游非編碼區(qū)，是rna聚合酶特異性識(shí)別和結(jié)合的dna片段。啟動(dòng)子的活性受到多種因素的影響，而在基因的異源表達(dá)中，常常需要根據(jù)實(shí)際需求選擇不同活性的啟動(dòng)子。
3、雖然目前已經(jīng)報(bào)道了許多來源的各式啟動(dòng)子以及啟動(dòng)子文庫，但未有針對(duì)土曲霉的啟動(dòng)子篩選技術(shù)，并且許多外源啟動(dòng)子在土曲霉工程菌中存在適應(yīng)性差的問題。因此，為了滿足后續(xù)代謝工程改造的需求，本專利技術(shù)構(gòu)建了土曲霉自身啟動(dòng)子文庫并進(jìn)行篩選。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、為解決上述問題，本專利技術(shù)的目的是提供一種土曲霉啟動(dòng)子文庫的構(gòu)建及啟動(dòng)子的篩選方法和應(yīng)用，以期篩選獲得不同強(qiáng)度的土曲霉來源的啟動(dòng)子并構(gòu)建啟動(dòng)子文庫。
2、一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N土曲霉啟動(dòng)子文庫的構(gòu)建方法，所述方法包括如下步驟：
3、步驟一、將待構(gòu)建
4、步驟二、將重組表達(dá)盒轉(zhuǎn)入工程菌色素合成相關(guān)基因位點(diǎn)，構(gòu)建重組工程菌，即獲得啟動(dòng)子文庫。
5、優(yōu)選的，所述待構(gòu)建啟動(dòng)子來源于土曲霉g2和/或土曲霉mefc01。
6、本申請(qǐng)中選擇土曲霉g2和土曲霉mefc01基因組進(jìn)行啟動(dòng)子篩選的目的為選擇產(chǎn)反式烏頭酸的土曲霉和產(chǎn)衣康酸的土曲霉作為篩選樣本，能夠使得篩選獲得的啟動(dòng)子更適用于產(chǎn)有機(jī)酸的土曲霉工程菌中，適于后續(xù)的有機(jī)酸生產(chǎn)過程。
7、可以理解的是，本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以根據(jù)不同需求選擇其他合成途徑相關(guān)工程菌基因組進(jìn)行篩選，本申請(qǐng)中在此不做具體限制。
8、進(jìn)一步地，所述重組表達(dá)盒還包括色素合成相關(guān)基因的同源臂；優(yōu)選的，所述重組表達(dá)盒還包括色素合成相關(guān)基因上游同源臂和色素合成相關(guān)基因下游同源臂。
9、優(yōu)選的，所述色素合成相關(guān)基因的同源臂的長(zhǎng)度大于1.0kb。
10、更優(yōu)選的，所述色素合成相關(guān)基因的同源臂的長(zhǎng)度為1.0-1.5kb。
11、在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述色素合成相關(guān)基因上游同源臂的序列如seq?idno.32所示，色素合成相關(guān)基因下游同源臂如seq?id?no.33所示。
12、其中，同源臂的作用為輔助重組表達(dá)盒轉(zhuǎn)入工程菌色素合成相關(guān)基因位點(diǎn)，以確保正確插入特定位點(diǎn)。
13、進(jìn)一步地，所述工程菌包括曲霉屬菌株；更優(yōu)選的，選自土曲霉、黑曲霉、巢曲霉、煙曲霉、米曲霉中的一種或多種；優(yōu)選的，所述工程菌為土曲霉。
14、在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述土曲霉為土曲霉mefc01。
15、進(jìn)一步地，所述色素合成相關(guān)基因包括pgma基因、mela基因和/或treta基因；更優(yōu)選的，所述色素合成相關(guān)基因包括mela基因。
16、其中，tera基因的gene?bank號(hào)為ateg_00145；pgma基因的gene?bank號(hào)為ateg_06206；mela基因的gene?bank號(hào)為ateg_03563。
17、本申請(qǐng)中首次將啟動(dòng)子插入色素合成相關(guān)基因位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)色素合成相關(guān)基因的定點(diǎn)敲除過程，即導(dǎo)致色素合成相關(guān)基因的失活，其失活后可通過菌落顏色發(fā)生明顯改變，因此操作人員可以直接根據(jù)菌落顏色的變化直接篩選重組工程菌，大大提高了文庫構(gòu)建效率。
18、進(jìn)一步地，所述報(bào)告基因選自熒光素酶報(bào)告基因、熒光標(biāo)記基因、抗性基因中的一種或多種；優(yōu)選的，所述報(bào)告基因包括熒光素酶報(bào)告基因。
19、在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述熒光素酶報(bào)告基因?yàn)閘uc基因。
20、優(yōu)選的，所述熒光素酶報(bào)告基因的核苷酸序列如seq?id?no.29所示。
21、進(jìn)一步地，所述重組表達(dá)盒還包括終止子。
22、在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述終止子為tpgk，所述終止子的核苷酸序列如seqid?no.30所示。
23、本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，可選擇任意終止子構(gòu)建上述重組表達(dá)盒，只要終止子能夠起到終止報(bào)告基因表達(dá)的功能即可，本申請(qǐng)?jiān)诖颂幉蛔鲞^多的限制。
24、本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠想到，在本申請(qǐng)所述重組表達(dá)盒的基礎(chǔ)上可適應(yīng)性添加其他常用表達(dá)元件輔助目的基因的表達(dá)，如添加標(biāo)簽、熒光蛋白標(biāo)記、抗性篩選標(biāo)記等。
25、在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，重組表達(dá)盒中含有抗性篩選標(biāo)記基因，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行選擇，本申請(qǐng)中不對(duì)抗性篩選標(biāo)記基因進(jìn)行強(qiáng)制性的限定。所述抗性篩選標(biāo)記基因可為hph基因，hph基因的核苷酸序列如seq?id?no.31所示。
26、在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述重組表達(dá)盒依次包括：待構(gòu)建啟動(dòng)子、報(bào)告基因、終止子、抗性篩選標(biāo)記基因。
27、進(jìn)一步地，所述將重組表達(dá)盒引入土曲霉的方法選自原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法、電轉(zhuǎn)化法、基因槍法、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法中的一種；優(yōu)選的，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法。
28、對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言可以理解，可以采用現(xiàn)有的基因編輯技術(shù)完成上述表達(dá)盒及重組工程菌的構(gòu)建。
29、在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，一種土曲霉啟動(dòng)子文庫的構(gòu)建方法，所述方法包括：
30、步驟一、自土曲霉基因組中獲得待構(gòu)建啟動(dòng)子，將待構(gòu)建啟動(dòng)子、報(bào)告基因、終止子、抗性篩選標(biāo)記基因依次連接獲得重組表達(dá)盒；
31、步驟二、將重組表達(dá)盒轉(zhuǎn)入工程菌色素合成相關(guān)基因位點(diǎn)，構(gòu)建重組工程菌，即獲得啟動(dòng)子文庫。
32、另一方面，本申請(qǐng)還提供了一種土曲霉啟動(dòng)子的篩選方法，所述方法包括：
33、步驟一、將待構(gòu)建啟動(dòng)子與報(bào)告基因依次連接獲得重組表達(dá)盒；所述待構(gòu)建啟動(dòng)子來源于土曲霉；
34、步驟二、將重組表達(dá)盒轉(zhuǎn)入工程菌色素合成相關(guān)基因位點(diǎn)，構(gòu)建重組工程菌；
35、步驟三、檢測(cè)重組工程菌中報(bào)告基因表達(dá)水平。
36、在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，一種土曲霉啟動(dòng)子的篩選方法，所述方法包括：
37、步驟一、自土曲霉基因組中獲得待構(gòu)建啟動(dòng)子，將待構(gòu)建啟動(dòng)子、熒光素酶報(bào)告基因、終止子、抗性篩選標(biāo)記基因依次連接獲得重組表達(dá)盒；
38、步驟二、將重組表達(dá)盒轉(zhuǎn)入工程菌色素合成相關(guān)基因位點(diǎn)，構(gòu)建重組工程菌；
39、步驟三、檢測(cè)重組工程菌與底物反應(yīng)所發(fā)出的熒光信號(hào)。
40、其中，利用酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光信號(hào)能夠反映熒光素酶報(bào)告基因的活性本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種土曲霉啟動(dòng)子文庫的構(gòu)建方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述重組表達(dá)盒還包括色素合成相關(guān)基因的同源臂；優(yōu)選的，所述重組表達(dá)盒還包括色素合成相關(guān)基因上游同源臂和色素合成相關(guān)基因下游同源臂。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述工程菌包括曲霉屬菌株；更優(yōu)選的，選自土曲霉、黑曲霉、巢曲霉、煙曲霉、米曲霉中的一種或多種；優(yōu)選的，所述工程菌為土曲霉。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述色素合成相關(guān)基因包括pgmA基因、melA基因和/或tretA基因；優(yōu)選的，所述色素合成相關(guān)基因包括melA基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述報(bào)告基因選自熒光素酶報(bào)告基因、熒光標(biāo)記基因、抗性基因中的一種或多種；優(yōu)選的，所述報(bào)告基因包括熒光素酶報(bào)告基因。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述重組表達(dá)盒還包括終止子。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述將重組表達(dá)盒引入土曲霉的方法選自原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法、電轉(zhuǎn)化法、基因槍法、農(nóng)桿
8.一種土曲霉啟動(dòng)子的篩選方法，其特征在于，所述方法包括：
9.一種權(quán)利要求8所述的篩選方法獲得的土曲霉啟動(dòng)子。
10.權(quán)利要求9所述的啟動(dòng)子在土曲霉重組菌株中的應(yīng)用。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種土曲霉啟動(dòng)子文庫的構(gòu)建方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述重組表達(dá)盒還包括色素合成相關(guān)基因的同源臂；優(yōu)選的，所述重組表達(dá)盒還包括色素合成相關(guān)基因上游同源臂和色素合成相關(guān)基因下游同源臂。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述工程菌包括曲霉屬菌株；更優(yōu)選的，選自土曲霉、黑曲霉、巢曲霉、煙曲霉、米曲霉中的一種或多種；優(yōu)選的，所述工程菌為土曲霉。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述色素合成相關(guān)基因包括pgma基因、mela基因和/或treta基因；優(yōu)選的，所述色素合成相關(guān)基因包括mela基因。
...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：呂雪峰，黃雪年，谷猛，張小溪，杜志強(qiáng)，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過程研究所，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
還沒有人留言評(píng)論。發(fā)表了對(duì)其他瀏覽者有用的留言會(huì)獲得科技券。