【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及生物基因工程重組，具體涉及一種人巨細胞病毒多優(yōu)勢表位重組嵌合抗原的構(gòu)建及純化方法。
技術(shù)介紹
1、人巨細胞病毒(human?cytomegalovirus，hcmv)為皰疹病毒科β屬的雙螺旋dna病毒，在妊娠期前后感染往往導(dǎo)致嚴重不良后果，如流產(chǎn)、發(fā)育畸形等，嚴重危害人類優(yōu)生優(yōu)育。隨著社會發(fā)展和科技進步，建立人巨細胞病毒快速、敏感、特異的檢測方法并采取早期的治療措施，對優(yōu)生、優(yōu)育及控制人巨細胞病毒的傳播的意義尤顯重要。
2、hcmv臨床檢測方法以免疫學(xué)檢測為主，其通過免疫學(xué)方法檢測人體血清中的hcmv-igg/igm抗體，用于hcmv感染的輔助診斷、免疫狀態(tài)的評估及醫(yī)療措施的制定。目前，我國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)注冊的hcmv抗體檢測試劑盒種類很多，但國產(chǎn)試劑盒和進口試劑盒檢測結(jié)果在靈敏度、特異性上還是有很大差距，有兩大主要原因：一是反應(yīng)體系，二是所采用的抗原，而所采用的抗原是體外診斷試劑盒開發(fā)的基礎(chǔ)，只有抗原的特異性和親和力都高的情況下，優(yōu)化檢測體系才有意義。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、為了解決上述技術(shù)問題，本專利技術(shù)提供一種人巨細胞病毒多優(yōu)勢表位重組嵌合抗原的構(gòu)建及純化方法，可以得到一種具有高特異性和親和力的hcmv重組嵌合抗原，該抗原可應(yīng)用于國內(nèi)人巨細胞病毒診斷試劑的開發(fā)和生產(chǎn)，減少臨床檢測中的假陽性、假陰性和交叉反應(yīng)，提高檢出率和準(zhǔn)確率。
2、為解決上述技術(shù)問題，本專利技術(shù)采用的技術(shù)方案為：
3、一種人巨細胞病毒多優(yōu)勢表位重組嵌合抗
4、s1、設(shè)計含有hcmv病毒的pp150蛋白(ul32)的aa595-614和aa951-1048、含有hcmv病毒的gp52蛋白(ul44)的aa202-433、含有hcmv病毒的pp65蛋白(ul83)的aa297-510、含有hcmv病毒的pp38蛋白(ul80a)的aa117-373的五個強優(yōu)勢抗原表位，并將五個強優(yōu)勢抗原表位通過柔性linker(ggc?ggc?ggc?ggc?agc)串聯(lián)在pet32a表達質(zhì)粒的kpn?i/xhol?i酶切位點，然后通過生物學(xué)軟件對目的基因片段序列進行大腸桿菌偏愛密碼子分析，將核酸序列轉(zhuǎn)換為大腸桿菌偏愛同義密碼子，得到優(yōu)化后的基因序列，該優(yōu)化后的基因序列如seq?idno:1所示；
5、s2、將優(yōu)化后的基因序列插入到pet32a質(zhì)粒的kpn?i/xho?i酶切位點進行基因重組，構(gòu)建獲得hcmv/pet32a質(zhì)粒；
6、s3、將hcmv/pet32a質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到bl21(de3)表達菌中，構(gòu)建表達菌cmv/pet32a/bl21(de3)；
7、s4、進行表達菌cmv/pet32a/bl21(de3)的iptg誘導(dǎo)表達，收集菌體；
8、s5、將收集的全菌菌體進行裂解變性；
9、s6、鎳柱親和純化；
10、s7、透析復(fù)性，收獲hcmv重組抗原。
11、進一步地，所述的步驟s5中，將收集的全菌菌體，按質(zhì)量體積比為1：15～1：30加入裂解液，裂解液組分為6m鹽酸胍或8m脲+20mm?pb+1～3mm咪唑+1～3mm?dtt，ph＝8.0，冰浴下超聲破碎，輸出功率90％，工作3s，間隔5s，超聲20～30min后，10000～12000rpm離心30min收集上清，0.22μm濾膜過濾除菌。
12、進一步地，所述的步驟s6中，包括：
13、(1)ni-nta鎳柱走純化水10～20個柱體積；
14、(2)裂解液平衡10～20柱體積至基線走平；
15、(3)低溫循環(huán)上樣1～3h；
16、(4)以8m脲+20mm?pb+5～10mm咪唑+1mm2-me為洗滌液，洗滌10～20柱體積；
17、(5)以8m脲+20mm?pb+250～400mm咪唑+1mm2-me為洗脫液，洗脫10個柱體積，收集洗脫峰，即為變性的hcmv純化抗原。
18、進一步地，所述的步驟s7中，將洗脫峰樣本裝入截留量10～30kd的透析袋，置于20～50倍體積的復(fù)性液中，4℃靜置透析過夜，日用無gsh/gssg的復(fù)性液進行二次透析，磁力攪拌3～5h換一次液，第3次換液后4℃靜置過夜，充分透析。
19、進一步地，所述的復(fù)性液為：20mm?tris+1mm?edta+50～100mm脲+0.2mm?gsh+0.1mm?gssg+2％～5％甘油，ph＝8.5。
20、進一步地，所述的步驟s7中，收集透析袋中液體，10000～12000rpm離心20min棄沉淀收上清，0.22μm過濾除菌，分裝后冷凍保存于-80℃或者凍干保存。
21、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本專利技術(shù)具有以下有益效果：
22、本專利技術(shù)將人巨細胞病毒(hcmv)五片段優(yōu)勢表通過串聯(lián)方式采用柔性linker連接，利用原核表達系統(tǒng)表達出具有高特異性和親和力的hcmv重組嵌合抗原，該抗原完全自主設(shè)計，生產(chǎn)純化成本低廉、特異性強、靈敏度高，可應(yīng)用于國內(nèi)人巨細胞病毒診斷試劑的開發(fā)和生產(chǎn)，減少臨床檢測中的假陽性、假陰性和交叉反應(yīng)，提高檢出率和準(zhǔn)確率。
23、本專利技術(shù)制備的hcmv五優(yōu)勢表位的嵌合抗原，誘導(dǎo)表達量高，易于純化和復(fù)性，且復(fù)性率較高，經(jīng)檢測臨床樣本對其抗原性評價，特異度達到100％，靈敏度和準(zhǔn)確的均能夠達到99％以上，能夠達到進口檢測試劑水平，極具應(yīng)用價值。
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1.一種人巨細胞病毒多優(yōu)勢表位重組嵌合抗原的構(gòu)建及純化方法，其特征在于：包括如下步驟：
2.如權(quán)利要求1所述的一種人巨細胞病毒多優(yōu)勢表位重組嵌合抗原的構(gòu)建及純化方法，其特征在于：所述的優(yōu)化后的基因序列如SEQ?ID?NO:1所示。
3.如權(quán)利要求1所述的一種人巨細胞病毒多優(yōu)勢表位重組嵌合抗原的構(gòu)建及純化方法，其特征在于：所述的步驟S5中，將收集的全菌菌體，按質(zhì)量體積比為1：15～1：30加入裂解液，裂解液組分為6M鹽酸胍或8M脲+20mM?PB+1～3mM咪唑+1～3mM?DTT，pH＝8.0，冰浴下超聲破碎，輸出功率90％，工作3s，間隔5s，超聲20～30min后，10000～12000rpm離心30min收集上清，0.22μm濾膜過濾除菌。
4.如權(quán)利要求1所述的一種人巨細胞病毒多優(yōu)勢表位重組嵌合抗原的構(gòu)建及純化方法，其特征在于：所述的步驟S6中，包括：
5.如權(quán)利要求1所述的一種人巨細胞病毒多優(yōu)勢表位重組嵌合抗原的構(gòu)建及純化方法，其特征在于：所述的步驟S7中，將洗脫峰樣本裝入截留量10～30kD的透析袋，置于20～50倍體積
6.如權(quán)利要求5所述的一種人巨細胞病毒多優(yōu)勢表位重組嵌合抗原的構(gòu)建及純化方法，其特征在于：所述的復(fù)性液為：20mM?Tris+1mM?EDTA+50～100mM脲+0.2mM?GSH+0.1mMGSSG+2％～5％甘油，pH＝8.5。
7.如權(quán)利要求5所述的一種人巨細胞病毒多優(yōu)勢表位重組嵌合抗原的構(gòu)建及純化方法，其特征在于：所述的步驟S7中，收集透析袋中液體，10000～12000rpm離心20min棄沉淀收上清，0.22μm過濾除菌，分裝后冷凍保存于-80℃或者凍干保存。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種人巨細胞病毒多優(yōu)勢表位重組嵌合抗原的構(gòu)建及純化方法，其特征在于：包括如下步驟：
2.如權(quán)利要求1所述的一種人巨細胞病毒多優(yōu)勢表位重組嵌合抗原的構(gòu)建及純化方法，其特征在于：所述的優(yōu)化后的基因序列如seq?id?no:1所示。
3.如權(quán)利要求1所述的一種人巨細胞病毒多優(yōu)勢表位重組嵌合抗原的構(gòu)建及純化方法，其特征在于：所述的步驟s5中，將收集的全菌菌體，按質(zhì)量體積比為1：15～1：30加入裂解液，裂解液組分為6m鹽酸胍或8m脲+20mm?pb+1～3mm咪唑+1～3mm?dtt，ph＝8.0，冰浴下超聲破碎，輸出功率90％，工作3s，間隔5s，超聲20～30min后，10000～12000rpm離心30min收集上清，0.22μm濾膜過濾除菌。
4.如權(quán)利要求1所述的一種人巨細胞病毒多優(yōu)勢表位重組嵌合抗原的構(gòu)建及純化方法，其特征在于：所述的步驟s6中，包括：
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：陳慶林，張陽，郭佳，劉穎，劉春紅，劉洪巖，李慧敏，陳曉光，
申請(專利權(quán))人：長春工業(yè)大學(xué)人文信息學(xué)院，
類型：發(fā)明
國別省市：
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