【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于游離脂肪酸檢測，具體涉及一種液相色譜質譜聯用技術測定體液中多種游離脂肪酸的方法及試劑盒。
技術介紹
1、游離脂肪酸(nefa)是指血清中未與甘油、膽固醇等酯化的脂肪酸，是由中性脂肪酸分解生成的存在于人體內的脂質，可以分解氧化后提供能量，又稱非酯化脂肪酸。nefa有很強的細胞毒性，可損害細胞膜、線粒體和溶酶體膜等，引起細胞內微器損害，而且能增強細胞因子毒性，在許多疾病(如糖尿病、冠心病、代謝綜合征以及過氧化酶體病)的病理生理中起重要作用。
2、脂肪酸可分成兩類：飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸。過量的飽和脂肪酸會使人發胖，是導致血膽固醇、三酰甘油、ldl-c升高的主要原因，繼發引起動脈管腔狹窄，形成動脈粥樣硬化，并增加造成心血管疾病的風險。不飽和脂肪酸主要包括單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸，它們分別都對人體健康有很大益處。不飽和脂肪酸又可以分為ω-3脂肪酸、ω-6脂肪酸、ω-7脂肪酸、ω-9脂肪酸和反式脂肪等。ω-3脂肪酸富集于大腦組織，在認知功能、行為功能以及大腦的正常生長發育過程中扮演著重要的角色。平衡攝取ω-3和ω-6，對保持良好的健康極為重要。超過于一定含量的ω-6脂肪酸：ω-3脂肪酸比值，可能會增加一些疾病如慢性心臟病發作、血栓性中風等的概率。最佳比例被認為是4比1或更低。ω-7脂肪酸是心血管保健品原料。ω-9脂肪酸被認為是一類可以降低膽固醇和促進免疫系統健康的脂肪酸，對預防心血管和中風等疾病很重要。反式脂肪對健康并無益處，也不是人體所需要的營養素。反式脂肪酸的攝入量與心血管疾病、乳腺癌和結腸癌等癌癥的
3、現有技術中對人體血液游離脂肪酸的檢測方法主要有氣相色譜法、液相色譜法以及酶法等。酶法靈敏度和特異性差，易受干擾，只能定量總nefas。基于gcms的脂質分析方法通常需要耗時的水解和衍生化程序，通常在預分餾脂質部分后應用，沒有水解和衍生化，許多脂類不適合gc。人體基質游離脂肪酸含量低、具有強極性和弱揮發性，因此需要先經過復雜的樣品前處理以富集和純化游離脂肪酸，然后再將游離脂肪酸進行甲酯化衍生(提高揮發性、熱穩定性和色譜分離)，才能進行gc分析，整個過程非常繁瑣、費時，且需要耗費大量有機溶劑。此外，上述方法還存在穩定性差，檢測靈敏度低等缺點，且水解和衍生化仍然可能妨礙量化。
技術實現思路
1、針對現有技術中游離脂肪酸檢測方法存在的問題，本專利技術的第一個目的是在于提供一種液相色譜串聯質譜測定體液中多種游離脂肪酸的方法，該方法操作快速簡便，檢測種類多，通量高、準確度高、成本低，可應用于非醫療治療目的對游離脂肪酸水平含量的檢測時，有助于研究脂質代謝通路。
2、本專利技術的第二個目的是在于提供一種液相色譜串聯質譜測定體液中多種游離脂肪酸的試劑盒，該試劑盒的設計與優化充分考慮了實驗室操作的便捷性、檢測的高效性以及結果的可靠性，該試劑盒集成了關鍵的化學試劑和標準品，旨在簡化游離脂肪酸的前處理步驟，同時確保檢測的準確度和重現性。
3、為了實現上述技術目的，本專利技術提供了一種液相色譜串聯質譜測定體液中多種游離脂肪酸的方法，該方法向96孔板中加入包含游離脂肪酸的體液樣本、同位素內標、沉淀劑和萃取劑混合后進行液液萃取，萃取液經過純化得待測樣品；所述待測樣品采用uplc-ms/ms進行檢測；
4、所述萃取劑為甲基叔丁基醚、正己烷(hex)和乙酸乙酯中的至少一種；
5、所述沉淀劑為含甲酸的甲醇和正己烷的混合溶液。
6、本專利技術的技術方案前處理過程無需使用復雜的固相萃取及衍生化處理關鍵在于前處理過程中針對體液中脂肪酸和其他蛋白成分的區別，先利用沉淀劑使得蛋白類成分快速沉淀，再通過對脂肪酸有良好溶解性的萃取劑對目標分析物進行提取，結合96孔板和自動化移液平臺的使用，大大簡化了前處理步驟操作和提高了通量，滿足大批量樣本的檢測需求，再通過對色譜條件的優化，利用液質聯用實現了一次實驗同時檢測c14～c28共22種游離脂肪酸的目的。
7、本專利技術采用的沉淀劑體系不僅可以快速實現蛋白的沉淀，而且可以提高游離脂肪酸在液質聯用的響應值，有利于后續檢測。進一步優選為甲醇和正己烷的體積比為40:10，含甲酸0.05vol％。
8、作為一種優選的方案，所述體液樣品包括血清、血漿、尿液、羊水和腦脊液。
9、作為一種優選的方案，所述游離脂肪酸包括肉豆蔻酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、油酸、反油酸、亞油酸、α-亞麻酸、γ-亞麻酸、二十烷酸、順式-8,11,14-二十碳三烯酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二烷酸、二十二碳四烯酸、二十二碳六烯酸、木蠟酸、神經酸、蠟酸、褐煤酸、植烷酸和降植烷酸中的至少兩種。
10、作為一種優選的方案，所述同位素內標包括13c3-肉豆蔻酸、13c4-棕櫚酸、d13-棕櫚油酸、十七烷酸、d3-硬脂酸、13c18-油酸、d17-反油酸、13c18-亞油酸、d5-亞麻酸、d4-二十烷酸、d6-順式-8,11,14-二十碳三烯酸、d8-花生四烯酸、d5-二十碳五烯酸、d4-二十二烷酸、d5-順-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸、d4-木蠟酸、d18-神經酸、d4-蠟酸、d3-3-甲基-植烷酸和d3-2-甲基-降植烷酸中的至少兩種。本專利技術所優選的同位素內標和目標分析物具有相近的極性。
11、作為一種優選的方案，所述uplc-ms/ms的條件為：
12、色譜條件：
13、色譜柱：c8柱，2.1×50mm，1.7μm；柱溫：35℃；洗脫液a：含甲酸銨和氨水的乙腈水溶液；洗脫液b：含氨水的乙腈異丙醇溶液，流速0.40ml/min，進樣量，3μl；梯度洗脫：初始0％b；0～0.25min，0～31％b；0.25～3.75min，31％b；3.75～3.8min，31～36.5％b；3.8～6.8min，36.5％b；6.8～8min，36.5～70％b；8～10min，70％b；10～10.75min，70～80％b；10.75～11.75min，80％b；11.75～11.76min，80～90％b；11.76～12min，90％b；12～12.1min，90～0％b；12.1～13.5min，0％b；
14、質譜條件：在電噴霧負離子模式下；采用多反應監測的質譜掃描模式，霧化氣：40kpa，加熱氣：40kpa，氣簾氣：50kpa，噴霧電壓：-4500v，去溶劑溫度：400℃，同時監測目標物和同位素內標。
15、作為一種優選的方案，所述純化為經離心采用自動化平臺移取上清液，氮吹、復溶，震蕩離心；所述復溶采用甲醇水溶液作為復溶液。
16、作為一種優選的方案，所述自動化平臺使用遺傳代謝樣本前處理系統，采用空氣置換式的移液模式，4通道自動化移液設備將上清液從萃取板轉移到上機板中。自動化轉板程序描述：開始移液→移液通道從槍頭位取槍頭→移液通道在萃取位吸液→移液通道在上機位吐液→移液通道在廢物槽去槍頭→整板移液結束。
17、作本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種液相色譜串聯質譜測定體液中多種游離脂肪酸的方法，其特征在于：向96孔板中加入包含游離脂肪酸的體液樣本、同位素內標、沉淀劑和萃取劑混合后進行液液萃取，萃取液經過純化得待測樣品；所述待測樣品采用UPLC-MS/MS進行檢測；
2.根據權利要求1所述的一種液相色譜串聯質譜測定體液中多種游離脂肪酸的方法，其特征在于：所述體液樣品包括血清、血漿、尿液、羊水和腦脊液；
3.根據權利要求2所述的一種液相色譜串聯質譜測定體液中多種游離脂肪酸的方法，其特征在于：所述同位素內標包括13C3-肉豆蔻酸、13C4-棕櫚酸、D13-棕櫚油酸、十七烷酸、D3-硬脂酸、13C18-油酸、D17-反油酸、13C18-亞油酸、D5-亞麻酸、D4-二十烷酸、D6-順式-8,11,14-二十碳三烯酸、D8-花生四烯酸、D5-二十碳五烯酸、D4-二十二烷酸、D5-順-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸、D4-木蠟酸、D18-神經酸、D4-蠟酸、D3-3-甲基-植烷酸和D3-2-甲基-降植烷酸中的至少兩種。
4.根據權利要求1～3任一項所述的一種液相色譜串聯質譜測定
5.根據權利要求4所述的一種液相色譜串聯質譜測定體液中多種游離脂肪酸的方法，其特征在于：所述純化為經離心采用自動化平臺移取上清液，氮吹、復溶，震蕩離心；
6.根據權利要求5所述的一種液相色譜串聯質譜測定體液中多種游離脂肪酸的方法，其特征在于：所述自動化平臺使用遺傳代謝樣本前處理系統，采用空氣置換式的移液模式，4通道自動化移液設備將上清液從萃取板轉移到上機板中。
7.權利要求1～6任一項所述的一種液相色譜串聯質譜測定體液中多種游離脂肪酸的試劑盒，其特征在于：包括洗脫液、同位素內標液、沉淀劑、萃取劑、校準品稀釋液、質控品、復溶液和色譜柱；
8.根據權利要求7所述的一種液相色譜串聯質譜測定體液中多種游離脂肪酸的試劑盒，其特征在于：所述校準品稀釋液由七個濃度的混合標準品溶液由校正線基質添加到混標工作液中稀釋制得；
9.根據權利要求8所述的一種液相色譜串聯質譜測定體液中多種游離脂肪酸的試劑盒，其特征在于：所述內標混合溶液中，13C3-肉豆蔻酸、13C4-棕櫚酸、D13-棕櫚油酸、十七烷酸、D3-硬脂酸、13C18-油酸、D17-反油酸、13C18-亞油酸、D5-亞麻酸、D4-二十烷酸、D6-順式-8,11,14-二十碳三烯酸、D8-花生四烯酸、D5-二十碳五烯酸、D4-二十二烷酸、D5-順-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸、D4-木蠟酸、D18-神經酸、D4-蠟酸、D3-3-甲基-植烷酸和D3-2-甲基-降植烷酸的濃度分別為100、200、200、120、200、500、100、1000、200、15、20、200、36、30、200、20、10、20、30、750μg/ml。
10.根據權利要求7所述的一種液相色譜串聯質譜測定體液中多種游離脂肪酸的試劑盒，其特征在于：所述質控品含有低、中、高濃度三個水平的質控血清，且質控品由活性炭凈化的血清空白樣本、無基質血清或無基質血漿添加混合游離脂肪酸標準物質制得。
...【技術特征摘要】
1.一種液相色譜串聯質譜測定體液中多種游離脂肪酸的方法，其特征在于：向96孔板中加入包含游離脂肪酸的體液樣本、同位素內標、沉淀劑和萃取劑混合后進行液液萃取，萃取液經過純化得待測樣品；所述待測樣品采用uplc-ms/ms進行檢測；
2.根據權利要求1所述的一種液相色譜串聯質譜測定體液中多種游離脂肪酸的方法，其特征在于：所述體液樣品包括血清、血漿、尿液、羊水和腦脊液；
3.根據權利要求2所述的一種液相色譜串聯質譜測定體液中多種游離脂肪酸的方法，其特征在于：所述同位素內標包括13c3-肉豆蔻酸、13c4-棕櫚酸、d13-棕櫚油酸、十七烷酸、d3-硬脂酸、13c18-油酸、d17-反油酸、13c18-亞油酸、d5-亞麻酸、d4-二十烷酸、d6-順式-8,11,14-二十碳三烯酸、d8-花生四烯酸、d5-二十碳五烯酸、d4-二十二烷酸、d5-順-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸、d4-木蠟酸、d18-神經酸、d4-蠟酸、d3-3-甲基-植烷酸和d3-2-甲基-降植烷酸中的至少兩種。
4.根據權利要求1～3任一項所述的一種液相色譜串聯質譜測定體液中多種游離脂肪酸的方法，其特征在于：所述uplc-ms/ms的條件為：
5.根據權利要求4所述的一種液相色譜串聯質譜測定體液中多種游離脂肪酸的方法，其特征在于：所述純化為經離心采用自動化平臺移取上清液，氮吹、復溶，震蕩離心；
6.根據權利要求5所述的一種液相色譜串聯質譜測定體液中多種游離脂肪酸的方法，其特征在于：所述自動化平臺使用遺傳代謝樣本前處理系統，采用空氣置換...
【專利技術屬性】
技術研發人員：蔡露露，陳湘悅，宋挺，張玉，王莉嬌，肖銳，
申請(專利權)人：杭州博圣醫學檢驗實驗室有限公司，
類型：發明
國別省市：
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