【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及寄生蟲檢測，具體涉及一種基于rpa-crispr/cas12a精準快速檢測弓形蟲的檢測試劑盒及一管法檢測方法。
技術介紹
1、弓形蟲(toxoplasma?gondii)是一種頂復門(phylum?apicomplexa)原生動物，可寄生于包括人在內的幾乎所有溫血動物，引起人畜共患寄生蟲病。弓形蟲典型的基因型包含i型、ii型和iii型，弓形蟲的致病性與蟲株的基因型和毒力相關，其中人易感染ii型蟲株，動物更易感染i型和iii型。據統計，犬、貓的弓形蟲感染率達到6％-88％；牛、羊等經濟動物的弓形蟲感染率達到12％-35％，這給畜牧業帶來巨大的經濟損失；同時，世界上約有三分之一的人口也有弓形蟲感染，給食品安全和人類健康埋下了重大隱患。
2、弓形蟲可作為食源性和水源性病原體，是一種機會致病性寄生蟲。感染弓形蟲可導致弓形蟲病，其呈世界性分布，是一種嚴重影響公共衛生健康和畜牧業經濟的寄生蟲病。人類弓形蟲病可引起發熱、咳嗽或呼吸困難等呼吸系統癥狀；厭食、腹瀉等腸胃系統癥狀以及通過血腦屏障誘發神經癥等。該病常呈隱形感染、臨床癥狀非特異性表現，故難以進行準確的臨床診斷。目前，尚無針對弓形蟲病治療效果顯著的疫苗和藥物，且弓形蟲病的治療藥物有較強的毒副作用，對于孕婦等特殊人群無有效治療方法。因此，對弓形蟲病的早期診斷和預防至關重要。
3、目前，弓形蟲的常用檢測方法主要包括病原學檢測、免疫學檢測和分子生物學檢測。其中最經典的檢測方法是病原學檢測，但其存在靈敏度度低、耗時長、工作量大以及對檢測人員技術要求高等缺點。
4、crispr-cas系統是近年來新開發的一種新型核酸檢測技術，在病原體檢測方面得到廣泛應用。其利用特異性crrna與靶標結合時，激活cas蛋白的旁側切割活性，無區別地切割周圍的dna或rna，包括靶標和報告基團。報告基團被切斷后發出熒光，并在此過程中進行至少104倍信號放大，從而實現靶標識別到熒光變化的信號轉換。相對于其他基于pcr的檢測技術，基于crispr/cas12的核酸檢測技術具有方便快捷、成本低廉、且無需昂貴設備和專業人員的優點，具有開發成現場檢測工具的潛力。
技術實現思路
1、針對現有技術的缺陷，本專利技術提供一種儀器依賴性小、操作快速簡單、靈敏度高且特異性好的用于弓形蟲現場快速檢測的rpa-crispr/cas12a檢測試劑盒，通過rpa與crispr技術結合，并篩選優化檢測用的rpa引物及crrna(crispr?rna)序列以進一步提高檢測弓形蟲的靈敏度。
2、本專利技術首先提供一種用于弓形蟲檢測的crrna序列，其檢測效果優異、靈敏度高且特異性好，具體地，所述特異性檢測弓形蟲的crrna序列為seq?id?no.7,seq?id?no.11,seqid?no.17,seq?id?no.18,seq?id?no.21,seq?id?no.23,或者seq?id?no.30；或者與之相差不超過2個堿基的核苷酸序列。
3、優選地，該crrna序列與seq?id?no.7,seq?id?no.11,seq?id?no.17,seq?idno.18,seq?id?no.21,seq?id?no.23,或者seq?id?no.30相差1個堿基。
4、本專利技術第二方面提供一種用于弓形蟲核酸檢測的rpa引物對，其擴增效率高且特異性好，該rpa引物對包含上游引物rpa-f和下游引物rpa-r，所述rpa引物對為:seq?idno.36/seq?id?no.39；seq?id?no.36/seq?id?no.42；seq?id?no.46/seq?id?no.51；seq?idno.46/seq?id?no.53；seq?id?no.46/seq?id?no.54；seq?id?no.55/seq?id?no.56；seq?idno.55/seq?id?no.58；或seq?id?no.55/seq?id?no.59，
5、或者與之相差不超過2個堿基的核苷酸序列對。
6、本專利技術第三方面提供一種用于弓形蟲核酸檢測的試劑盒，所述試劑盒包括rpa-crispr/cas12a系統，所述rpa-crispr/cas12a系統包含如上所述的crrna序列，和/或如上所述的rpa引物對。
7、進一步的，所述試劑盒還包括cas12a蛋白以及具有熒光信號標記的單鏈dna。
8、進一步的，所述試劑盒還包括a?buffer和b?buffer。
9、進一步的，所述單鏈dna為ssdna?fq-labeled?reporter，具體序列為：5′-fam-ttatt-bhq-3′。
10、進一步的，所述rpa-crispr/cas12a系統還包括rpa擴增體系和crispr/cas12a檢測體系所需的其他試劑。
11、進一步的，所述試劑盒中的所有成分在一個反應容器中進行反應。
12、本專利技術第四方面提供一種用于非診斷目的的弓形蟲核酸快速檢測的方法，所述方法基于rpa-crispr/cas12a檢測系統，通過設計的高特異性、高效率和高靈敏度的優質crrna，和高特異性、高擴增效率的rpa引物保證了弓形蟲核酸檢測效果，具體地，該方法使用如上所述的試劑盒來執行。
13、進一步的，所述方法包括恒溫擴增反應，所述反應的溫度為37℃。
14、與現有技術相比，本專利技術的有益效果為：
15、(1)本專利技術提供一種用于弓形蟲檢測的crrna和rpa引物對，其中crrna具有良好特異性，rpa引物對具有高擴增效率，均與檢測的靈敏度和準確度直接相關。本專利技術還對crrna和rpa引物進行了聯合篩選，進一步提高了本專利技術方法的靈敏度和準確度，最低可以檢出10拷貝的靶標dna，與其他寄生蟲如弓首蛔蟲、犬新孢子蟲等不存在交叉反應，有利于弓形蟲早期感染的快速檢測以及預防。
16、(2)本專利技術還提供一種用于弓形蟲檢測的基于rpa-crispr/cas12a系統的一管法檢測技術，所有成分在一個反應容器中完成檢測反應，減少了液體轉移的步驟，降低了氣溶膠污染的風險。
17、(3)本專利技術的檢測方法成本低，不需專業規范的實驗室，無需使用昂貴的儀器設備(熒光定量pcr儀等)，只需要水浴鍋或恒溫培養箱和熒光檢測儀即可，適合一線使用，降低了檢測成本。
18、(4)本專利技術的檢測方法檢測時間短，在恒溫擴增的同時，crispr-cas12a發揮切割活性，檢測熒光變化，僅需30-60分鐘便可完成檢測。
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1.一種用于弓形蟲核酸檢測的crRNA序列，所述crRNA序列為SEQ?ID?NO.7,SEQ?IDNO.11,SEQ?ID?NO.17,SEQ?ID?NO.18,SEQ?ID?NO.21,SEQ?ID?NO.23,或者SEQ?ID?NO.30；或者與之相差不超過2個堿基的核苷酸序列。
2.一種用于弓形蟲核酸檢測的RPA引物對，所述RPA引物對包含上游引物RPA-F和下游引物RPA-R，所述RPA引物對為:SEQ?ID?NO.36/SEQ?ID?NO.39；SEQ?ID?NO.36/SEQ?IDNO.42；SEQ?ID?NO.46/SEQ?ID?NO.51；SEQ?ID?NO.46/SEQ?ID?NO.53；SEQ?ID?NO.46/SEQ?IDNO.54；SEQ?ID?NO.55/SEQ?ID?NO.56；SEQ?ID?NO.55/SEQ?ID?NO.58；或SEQ?ID?NO.55/SEQID?NO.59，
3.一種用于弓形蟲核酸檢測的試劑盒，所述試劑盒包括如權利要求1所述的crRNA序列，和/或如權利要求2所述的RPA引物對。
4.如權利
5.如權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括A?buffer和B?buffer。
6.如權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述具有熒光信號標記的單鏈DNA為5′-FAM-TTATT-BHQ-3′。
7.如權利要求3-6中任一項所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中的所有成分在一個反應容器中進行反應。
8.一種用于非診斷目的的弓形蟲檢測方法，使用如權利要求3-7中任一項所述的試劑盒來執行。
9.如權利要求8所述的檢測方法，其特征在于，所述方法包括恒溫擴增反應，所述反應的溫度為37℃。
...【技術特征摘要】
1.一種用于弓形蟲核酸檢測的crrna序列，所述crrna序列為seq?id?no.7,seq?idno.11,seq?id?no.17,seq?id?no.18,seq?id?no.21,seq?id?no.23,或者seq?id?no.30；或者與之相差不超過2個堿基的核苷酸序列。
2.一種用于弓形蟲核酸檢測的rpa引物對，所述rpa引物對包含上游引物rpa-f和下游引物rpa-r，所述rpa引物對為:seq?id?no.36/seq?id?no.39；seq?id?no.36/seq?idno.42；seq?id?no.46/seq?id?no.51；seq?id?no.46/seq?id?no.53；seq?id?no.46/seq?idno.54；seq?id?no.55/seq?id?no.56；seq?id?no.55/seq?id?no.58；或seq?id?no.55/seqid?no....
【專利技術屬性】
技術研發人員：張旭，董露，蓋作啟，李鳳，
申請(專利權)人：艾迪醫學科技廣州有限公司，
類型：發明
國別省市：
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