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    一種去分化天山雪蓮細胞的制備方法及其抗皺緊致應用技術

    技術編號:43713361 閱讀:16 留言:0更新日期:2024-12-18 21:26
    本發明專利技術公開了一種去分化天山雪蓮細胞的制備方法及其抗皺緊致應用,具體步驟如下:S1:取無菌苗根尖轉接至誘導培養基,增殖形成細胞團;取細胞團至含有增殖培養基的培養皿中培養,得到初級天山雪蓮干細胞;S2:將所得初級天山雪蓮干細胞轉移至液體MS培養基中懸浮培養,同時改變光照條件,培養獲得總黃酮含量、綠原酸含量明顯增加的天山雪蓮干細胞。本發明專利技術方法通過植物細胞培養技術實現天山雪蓮干細胞的規模化生產,解決了天然資源稀缺的問題,實現原料珍稀但可持續;本發明專利技術采用獨特的培養條件、誘導劑組合,提高了雪蓮干細胞的活性和活性成分含量,實現工藝創新;同時本發明專利技術制備的天山雪蓮干細胞為護膚品行業提供了一種具有抗皺緊致功效的安全原料。

    【技術實現步驟摘要】

    本專利技術涉及醫療衛生,具體涉及一種去分化天山雪蓮細胞的制備方法及其抗皺緊致應用


    技術介紹

    1、天山雪蓮被譽為“百草之王”,其根部、莖、葉富含生物堿、黃酮類、揮發油、內脂、甾體類、多糖及還原性物質,具有活血通絡、散寒除濕等功效,可治療多種疾病,如風濕性關節炎等。

    2、由于過度采集和棲息地破壞,野生天山雪蓮的數量銳減,已被列為國家二級保護植物。為了保護這一珍稀資源,在人工控制的最優條件下通過植物細胞培養技術培育出去分化天山雪蓮細胞,不僅保留了野生天山雪蓮的化學成分和藥理作用,甚至在某些活性成分上超越野生品種,此外,細胞培養技術還能避免農殘和重金屬污染,確保了產品的安全性。去分化植物細胞起源于haberland在1902年的研究。在過去的40年中,植物細胞培養物已經被用于感興趣的代謝產物的生產以及完全一樣的植株的增殖(體細胞胚胎發生)。這種植物生物技術是基于細胞全能型的概念:“任何一個植物細胞能夠去分化并且再生成另一個與所述細胞來源相同的新個體”。去分化植物細胞是來源于器官(葉、莖、根、花瓣等)的植物細胞,其經過培養、再次生成它的去分化形式,即失去了它的葉、莖、根、花瓣的特異性,能夠再次生成完整的植株。未分化植物細胞相當于源自植物分生組織細胞的真正的植物干細胞,并且不具有器官特異性的生物學歷史。

    3、天山雪蓮的護膚功效包括保濕滋潤、抗氧化、抗炎、淡化色斑、抗衰老和抗皺等。這些特性使得雪蓮花提取物成為化妝品行業中的寶貴成分。通過植物細胞培養技術生產的天山雪蓮干細胞,可以作為天然成分用于開發抗皺緊致等護膚產品,為化妝品市場提供了新的選擇。

    4、可見,天山雪蓮的保護和可持續利用不僅對生物多樣性保護具有重要意義,而且對開發新型天然藥品和化妝品具有巨大的經濟潛力。通過現代生物技術的應用,可以實現這一珍稀植物資源的有效保護和合理利用。例如現有技術cn104498425b公開了一種雪蓮干細胞的分離培養方法及在制備抗衰老產品中的應用。具體是取天山雪蓮幼嫩葉片,對其消毒后首先利用固體培養基分離天山雪蓮干細胞,再利用液體培養基對其進行傳代配養;所述固體培養基含有無機鹽、維生素、氨基酸、生長素、糖類和活性炭;液體培養基含有無機鹽、維生素、氨基酸、生長素、糖類和添加物。該專利以保護眼霜為主。cn110923190a是一種提高雪蓮細胞培養物黃酮苯丙素類化合物的方法,所述方法中使用的培養基中,磷元素濃度0.5-3mmol/l,no3-離子濃度20-35mmol/l,nh4+離子濃度0-30mmol/l,ca2+離子濃度0.5-3mmol/l,mg2+離子濃度為0.2-1.5mmol/l,硼離子濃度0.02-0.1mmol/;在培養基中可添加誘導劑或前體或旁路代謝抑制劑;最終顯著提高了雪蓮細胞培養物的總黃酮含量及蘆丁、綠原酸、紫丁香苷、1,5二咖啡酰奎尼酸的含量。cn116103219b涉及一種雪蓮干細胞粉的制備方法及其制得的抑菌劑,屬于醫療衛生領域,該雪蓮干細胞粉的制備方法,其制備步驟如下:選擇天山雪蓮未分化的根部末端作為外植體,先進行清洗、消毒預處理,之后在一定條件下對其進行初代培養和傳代培養,之后在一定條件進行擴大培養,最后進行過濾、干燥等后處理步驟,可以制得具有較佳愈合作用的雪蓮根部干細胞凍干粉。cn106867958a一種大規模繼代培養天山雪蓮細胞的工藝,包括以下步驟:1)天山雪蓮細胞系篩選:采用天然雪蓮試管苗進行外植體誘導,獲得愈傷組織;2)搖瓶規模繼代培養:挑選生長狀態良好,顏色鮮亮,質地緊實的固體細胞放入含有培養液的搖瓶中,每7-10天繼代一次;3)搖瓶轉反應器繼代培養:將搖瓶中細胞轉接到反應器中進行繼代培養,每次繼代培養的培養周期為7-10天;通過優化培養條件和控制溶氧量,實現了細胞的均勻分散和有效成分含量的提高。這種工藝更有利于天山雪蓮細胞中有效成分的均衡產生,為研發人員提供一種更加高效和穩定的天山雪蓮細胞培養方法,等等。

    5、盡管在前人的研究基礎上,天山雪蓮干細胞制備方法及應用已有所提高,但要滿足工業化生產的需求,還有待研發人員提供更多的方法。


    技術實現思路

    1、鑒于此,本專利技術的目的在于提供一種去分化天山雪蓮細胞的制備方法及其抗皺緊致應用,本專利技術通過利用植物細胞培養技術來生產天山雪蓮(saussurea?involucrata)干細胞,其活性成分含量高、培養周期短、細胞產量高,且這些富含活性成分的天山雪蓮干細胞凍干粉具有抗皺緊致功效,為護膚品行業帶來了一種全新的、天然來源的抗皺緊致成分。

    2、一方面,本專利技術提供一種去分化天山雪蓮細胞制備方法,具體步驟如下:

    3、s1:取無菌苗根尖轉接至誘導培養基,增殖形成細胞團;取細胞團至含有增殖培養基的培養皿中培養,得到初級天山雪蓮干細胞;

    4、s2:將所得初級天山雪蓮干細胞轉移至液體ms培養基中懸浮培養,同時改變光照條件,培養獲得總黃酮含量、綠原酸含量明顯增加的天山雪蓮干細胞。

    5、進一步地,所述無菌苗根尖取自生長期至10天苗齡期的天山雪蓮無菌苗。進一步地,所述天山雪蓮無菌苗的培育過程為:取天山雪蓮種子,清洗后,經預處理、浸泡、漂洗后接種培育獲得。進一步地,所述清洗運用自來水沖洗20~30min。進一步地,所述預處理是指用100mg/l?ga3(赤霉素)溶液進行預處理12h。進一步地,所述浸泡是用70%的乙醇浸泡30s。進一步地,所述漂洗是指用1%的次氯酸鈉溶液震蕩漂洗8~10min。進一步地,所述接種培育的培養基為含蔗糖30g/l、瓊脂6g/l的ms培養基。

    6、進一步地,本專利技術所述ms培養基為含有如表1所示組分的培養基,基本物質組成為:nh4no3?412.5mg/l、na2moo4·2h2o?0.25mg/l、cacl2?332.2mg/l、ki?0.83mg/l、mgso4180.7?mg/l、znso4·7h2o?8.6mg/l、kno3?475mg/l、cuso4·5h2o?0.025mg/l、kh2po4170mg/l、fenaedta?36.7mg/l、h3bo3?6.2mg/l、mnso4·h2o?16.9mg/l、cocl2·6h2o?0.025mg/l、glycine?2mg/l、inositol?100mg/l、nicotinic?acid

    7、0.5mg/l、pyridoxine?hcl?0.5mg/l、thiamine?hcl?0.1mg/l。

    8、進一步地,所述接種培育的條件為25℃的溫度、12h光照/12h黑暗的光周期。

    9、進一步地,所述誘導培養基為含1.0mg/l?iba(吲哚丁酸)、0.5mg/l?kt(激動素)、30g/l蔗糖和6g/l?agar(瓊脂)的ms培養基,ph值調至5.8-6.2。進一步地,s1中增殖形成細胞團的培養條件為置于25℃的黑暗環境下培養14d。

    10、進一步地,所述增殖培養基為含蔗糖和激素的ms培養基。進一步地,所述激素選自6-芐基氨基嘌呤、2,4-二氯苯氧乙酸、吲哚丁本文檔來自技高網...

    【技術保護點】

    1.一種去分化天山雪蓮細胞制備方法,其特征在于,具體步驟如下:

    2.根據權利要求1所述制備方法,其特征在于,所述無菌苗根尖取自生長期至10天苗齡期的天山雪蓮無菌苗;所述天山雪蓮無菌苗的培育過程為:取天山雪蓮種子,清洗后,經預處理、浸泡、漂洗后接種培育獲得。

    3.根據權利要求2所述制備方法,其特征在于,所述清洗運用自來水沖洗20~30min;所述預處理是指用100mg/L?GA3溶液進行預處理12h;所述浸泡是用70%的乙醇浸泡30s;所述漂洗是指用1%的次氯酸鈉溶液震蕩漂洗8~10min;所述接種培育的培養基為含蔗糖30g/L、瓊脂6g/L的MS培養基;所述接種培育的條件為25℃的溫度、12h光照/12h黑暗的光周期。

    4.根據權利要求1所述制備方法,其特征在于,所述誘導培養基為含1.0mg/L?IBA、0.5mg/L?KT、30g/L蔗糖和6g/L?Agar的MS培養基,pH值調至5.8-6.2;進一步優選地,S1中增殖形成細胞團的培養條件為置于25℃的黑暗環境下培養14d。

    5.根據權利要求1所述制備方法,其特征在于,所述增殖培養基為含蔗糖和激素的MS培養基;進一步優選地,所述激素選自6-芐基氨基嘌呤、2,4-二氯苯氧乙酸、吲哚丁酸、IAA、NAA中至少一種;進一步優選地,所述激素選自0.5mg/L?6-BA+1.0mg/L?2,4-D的組合、0.5mg/L?6-BA+2.0mg/L?2,4-D的組合、1.0mg/L?6-BA+1.0mg/L?2,4-D的組合、1.0mg/L6-BA+2.0mg/L?2,4-D的組合、0.5mg/L?6-BA+2.0mg/L?IBA的組合、0.5mg/L?6-BA+2.0mg/LIAA的組合、0.5mg/L?6-BA+2.0mg/L?NAA的組合、2.0mg/L?2,4-D、0.5mg/L?6-BA中至少一種。

    6.根據權利要求5所述制備方法,其特征在于,所述增殖培養基為含30g/L蔗糖、0.5mg/L?6-芐基氨基嘌呤、2.0mg/L?2,4-二氯苯氧乙酸的MS培養基;進一步優選地,所述增殖培養基需高壓滅菌鍋在121℃的溫度和0.1MPa的壓力下滅菌20min;進一步優選地,S1中,增殖培養的條件為將天山雪蓮干細胞置于25℃的黑暗環境下培養14d。

    7.根據權利要求1所述制備方法,其特征在于,S2中,所述液體MS培養基含有誘導劑、蔗糖、6-BA和2,4-D;進一步優選地,所述誘導劑選自L-苯丙氨酸和MT中至少一種。

    8.根據權利要求7所述制備方法,其特征在于,所述液體MS培養基含有50mg/L?L-苯丙氨酸、20mg/L的MT、30g/L蔗糖、0.5mg/L?6-BA和2.0mg/L?2,4-D;進一步地,所述液體MS培養基的pH值5.8-6.2;進一步地,所述液體MS培養基在接種初級天山雪蓮干細胞前,經過高壓滅菌處理;進一步地,所述高壓滅菌條件為在高壓滅菌鍋中,121℃的溫度和0.1MPa的壓力下滅菌20min。

    9.根據權利要求1所述制備方法,其特征在于,所述光照條件為選擇不同的光,光照總強度為32μmol/(m2·s),光照時間為12h/d;進一步優選地,所述不同光選自紅光、白光、藍光或黑暗中至少一種;進一步優選地,所述不同光指采用紅光和藍光按1:1強度比例使用,其中,藍光中心波長為457nm,紅光中心波長為660nm;

    10.一種權利要求1~9任一項所述方法制備的去分化天山雪蓮細胞在具有抗皺緊致功效的用品中的應用;進一步地,所述用品為化妝品或凍干粉劑。

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    【技術特征摘要】

    1.一種去分化天山雪蓮細胞制備方法,其特征在于,具體步驟如下:

    2.根據權利要求1所述制備方法,其特征在于,所述無菌苗根尖取自生長期至10天苗齡期的天山雪蓮無菌苗;所述天山雪蓮無菌苗的培育過程為:取天山雪蓮種子,清洗后,經預處理、浸泡、漂洗后接種培育獲得。

    3.根據權利要求2所述制備方法,其特征在于,所述清洗運用自來水沖洗20~30min;所述預處理是指用100mg/l?ga3溶液進行預處理12h;所述浸泡是用70%的乙醇浸泡30s;所述漂洗是指用1%的次氯酸鈉溶液震蕩漂洗8~10min;所述接種培育的培養基為含蔗糖30g/l、瓊脂6g/l的ms培養基;所述接種培育的條件為25℃的溫度、12h光照/12h黑暗的光周期。

    4.根據權利要求1所述制備方法,其特征在于,所述誘導培養基為含1.0mg/l?iba、0.5mg/l?kt、30g/l蔗糖和6g/l?agar的ms培養基,ph值調至5.8-6.2;進一步優選地,s1中增殖形成細胞團的培養條件為置于25℃的黑暗環境下培養14d。

    5.根據權利要求1所述制備方法,其特征在于,所述增殖培養基為含蔗糖和激素的ms培養基;進一步優選地,所述激素選自6-芐基氨基嘌呤、2,4-二氯苯氧乙酸、吲哚丁酸、iaa、naa中至少一種;進一步優選地,所述激素選自0.5mg/l?6-ba+1.0mg/l?2,4-d的組合、0.5mg/l?6-ba+2.0mg/l?2,4-d的組合、1.0mg/l?6-ba+1.0mg/l?2,4-d的組合、1.0mg/l6-ba+2.0mg/l?2,4-d的組合、0.5mg/l?6-ba+2.0mg/l?iba的組合、0.5mg/l?6-ba+2.0mg/liaa的組合、0.5mg/l?6-ba+2...

    【專利技術屬性】
    技術研發人員:羅彬彬李安章侯森
    申請(專利權)人:廣州梵之容化妝品有限公司
    類型:發明
    國別省市:

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